KLF12在宮頸癌中的表達及其調控IL-6/STAT3通路影響宮頸癌細胞增殖和凋亡的機制研究

包克勇 陶曉玉 張 雪 張 莉 王 東

（內蒙古民族大學附屬醫院西醫婦科，通遼028000）

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，病理組織學多數為鱗癌，少數為腺癌，近年宮頸癌發病率持續上升，并呈現年輕化趨勢，是導致婦女死亡的重要原因之一[1］。Krüpple樣轉錄因子12（Krüpple-like factor 12，KLF12）是KLF家族成員，參與脂代謝、腎臟發育、腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲遷移等過程[2-3］。多種腫瘤中KLF12異常表達，其異常表達可影響腫瘤生長[4-5］。宮頸癌中KLF12研究較少，研究發現，92例宮頸癌患者中大部分患者KLF12呈高表達，KLF12高表達患者5年生存率明顯降低，且KLF12高表達與患者淋巴結轉移、臨床分期和宮旁浸潤密切相關[6］。IL-6/STAT3信號通路在多種腫瘤中異常激活，其異常激活可影響腫瘤侵襲遷移、凋亡等多種生物學過程[7-8］。本研究旨在觀察抑制KLF12表達對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響，并進一步探討IL-6/STAT3信號通路在此過程中的作用，為宮頸癌診治提供依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床標本 收集2017年3月至2019年2月于我院就診的宮頸癌患者術后切除的宮頸癌組織標本及相應癌旁組織（距離腫瘤邊緣>3 cm）共42例，所有病例經我院病理醫生復閱確認，年齡36～66歲，中位年齡45歲。所有病例術前均未接受放化療及其他抗腫瘤治療，術后30 min將所有病例標本置于液氮中凍存，?80℃保存，用于后續實驗。所有樣本采集前均得到患者知情同意，經我院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞株 正常宮頸上皮永生化細胞End1/E6E7及宮頸癌C33A、HeLa和SiHa購自美國菌種保藏中心。

1.1.3 主要試劑和儀器 DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購自中國碧云天公司；BCA試劑盒購自北京中杉金橋公司；KLF12、STAT3、p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2和Bax抗體購自美國Abcam公司；CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所；酶標儀購自美國Thermo公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 正常宮頸細胞及宮頸癌細胞采用含10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養基培養，37℃、5%CO2，細胞覆蓋瓶底70%左右時，胰酶消化，傳代。轉染前24 h接種生長至對數期的宮頸癌C33A細胞于6孔板，1 ml/孔加入細胞（約1×105個），生長至60%融合時進行轉染。轉染參照LipofectamineTM2000說明，KLF12特異性siRNA（si-KLF12組）、無意義siRNA（si-NC組）及Lipo‐fectamineTM2000中分別加入無血清培養基，將稀釋后的siRNA與LipofectamineTM2000混勻，加入6孔板相應孔，僅加入脂質體的為對照組，轉染后常規孵育5～6 h，更換為無抗生素含血清培養液繼續培養48 h，Western blot檢測轉染后細胞KLF12表達。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達 提取組織，轉染si-KLF12，根據預實驗選擇的5 mg/ml重組人IL-6（RhIL-6）處理的轉染si-KLF12的細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，100℃沸水中變性5 min，40 μg/孔加入變性蛋白，SDS-PAGE分離蛋白（220 V，2 h），電泳，取出凝膠，移至電轉移槽（100 V，90 min），取下轉好的PVDF膜，根據Marker切膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加一抗（1∶1000）4℃孵育過夜，洗膜，加HRP標記的二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色，曝光。Bio-Rad成像系統分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值，實驗重復3次。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 200 μl/孔（約5×103個）接種生長至對數期的C33A細胞于96孔板，采用含10%胎牛血清的DMEM培養基37℃、5%CO2培養24 h，采用KLF12 siRNA及KLF12 siRNA+RhIL-6處理細胞，分別在培養24 h、48 h和72 h加入CCK-8試劑（10 μl/孔），常規孵育3 h，取出培養板，酶標儀測定490 nm處各孔光密度（OD）值，實驗重復3次[9］。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡 收集經KLF12 siRNA及KLF12 siRNA+RhIL-6處理的細胞，預冷PBS洗滌2次，將10×Binding Buffer采用去離子水稀釋為1×Binding Buffer，1×106個/ml重懸細胞于1×Binding Buffer中，取300 μl細胞懸液，加入流式管中，加5 μl Annexin V-FITC于流式管中，微量移液器混勻，室溫（25℃）避光孵育15 min，加入5 μl PI，混勻，在流式管中加入200 μl 1×Binding Buffer，1 h內流式細胞儀分析，實驗重復3次[10］。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KLF12在宮頸癌組織及細胞中的表達KLF12在宮頸癌組織中表達（0.622±0.063）明顯高于癌旁組織（0.083±0.012，P<0.05，圖1A），與正常宮頸上皮永生化細胞End1/E6E7（0.075±0.010）相比，宮 頸 癌C33A（0.525±0.058）、HeLa（0.201±0.022）和SiHa（0.314±0.028）細胞中KLF12表達均明顯升高（P<0.01，圖1B）。宮頸癌C33A細胞中KLF12表達最高，因此選擇C33A細胞進行后續實驗。

圖1 Western blot檢測宮頸癌組織及細胞中KLF12表達Fig.1 Expression of KLF12 in cervical cancer tissues and cells detected by Western blot

2.2 C33A細胞轉染KLF12 siRNA后KLF12表達KLF12 siRNA轉染C33A細胞48 h，KLF12表達明顯低于對照組（P<0.01），si-NC組KLF12表達與對照組差異無統計學意義（P>0.05，圖2、表1）。

表1 C33A細胞轉染KLF12 siRNA后KLF12表達（±s）Tab.1 KLF12 expression in C33A cells transfected with KLF12 siRNA（±s）

表1 C33A細胞轉染KLF12 siRNA后KLF12表達（±s）Tab.1 KLF12 expression in C33A cells transfected with KLF12 siRNA（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.01.

Groups Control si-NC si-KLF12 F P KLF12 protein expression 0.688±0.0720.675±0.0690.159±0.0211）78.8950.000

圖2 Western blot檢測C33A細胞轉染KLF12 siRNA后KLF12表達Fig.2 KLF12 expression detected by Western blot after KLF12 siRNA transfected into C33A cells

2.3 抑制KLF12表達對C33A細胞增殖、凋亡的影響 si-NC組和對照組細胞活力及凋亡率差異均無統計學意義（P>0.05），si-KLF12組細胞活力明顯低于對照組，凋亡率高于對照組（P<0.01，圖3、表2）。

表2 抑制KLF12表達對C33A細胞增殖活力及凋亡率的影響（±s）Tab.2 Effect of inhibiting KLF12 expression on prolifera?tion activity and apoptosis rate of C33A cells（±s）

表2 抑制KLF12表達對C33A細胞增殖活力及凋亡率的影響（±s）Tab.2 Effect of inhibiting KLF12 expression on prolifera?tion activity and apoptosis rate of C33A cells（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.01.

Groups Control si-NC si-KLF12 F P OD490 24 h 0.489±0.0420.496±0.0450.313±0.0341）19.5690.00248 h 0.747±0.0630.734±0.0610.505±0.0481）16.6860.00472 h 0.993±0.0861.003±0.0890.710±0.0741）11.9780.008 Apoptosis rate（%）2.31±0.222.25±0.2123.46±2.131）290.7040.000

圖3 抑制KLF12表達對C33A細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of KLF12 inhibition on apoptosis of C33A cells

2.4 抑制KLF12表達對IL-6/STAT3信號通路的影響 各組細胞STAT3表達差異無統計學意義（P>0.05），與si-NC組相比，si-KLF12組p-STAT3表達明顯降低，si-NC+RhIL-6組p-STAT3表達明顯升高（P<0.01），與si-KLF12+RhIL-6組相比，si-KLF12組p-STAT3表 達 明 顯降低，si-NC+RhIL-6組p-STAT3表達明顯升高（P<0.01，圖4、表3）。

圖4 Western blot檢測各組C33A細 胞STAT3和p-STAT3表達Fig.4 Western blot to detect STAT3 and p-STAT3 ex?pressions of C33A cells in each group

表3 各組STAT3和p-STAT3蛋白表達（±s）Tab.3 Expressions of STAT3 and p-STAT3 in each group（±s）

表3 各組STAT3和p-STAT3蛋白表達（±s）Tab.3 Expressions of STAT3 and p-STAT3 in each group（±s）

Note：Compared with si-NC，1）P<0.01；compared with si-KLF12+Rh IL-6，2）P<0.01.

Groups si-NC si-KLF12 si-NC+RhIL-6 si-KLF12+RhIL-6 F P STAT30.283±0.0350.291±0.0270.278±0.0330.296±0.0290.2000.894 p-STAT30.102±0.0110.043±0.0061）2）0.242±0.0181）2）0.126±0.016113.4370.000

2.5 抑制KLF12表達對CyclinD1、Bcl-2和Bax表達的影響 與si-NC組相比，si-KLF12組CyclinD1和Bcl-2表達明顯降低，Bax表達明顯升高，si-NC+RhIL-6組CyclinD1和Bcl-2表達明顯升高，Bax表達明顯降低（P<0.01），與si-KLF12+RhIL-6組相比，si-KLF12組CyclinD1和Bcl-2表達明顯降低，Bax表達明顯升高，si-NC+RhIL-6組CyclinD1和Bcl-2表達明顯升高，Bax表達明顯降低（P<0.01，圖5、表4）。

圖5 Western blot檢測各組C33A細胞CyclinD1、Bcl-2和Bax表達Fig.5 Western blot to detect CyclinD1，Bcl-2 and Bax ex?pressions in C33A cells

表4 各組細胞CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達（±s）Tab.4 Proteins expressions of CyclinD1，Bcl-2 and Bax of cells in each group（±s）

表4 各組細胞CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達（±s）Tab.4 Proteins expressions of CyclinD1，Bcl-2 and Bax of cells in each group（±s）

Note：Compared with si-NC，1）P<0.01；compared with si-KLF12+RhIL-6，2）P<0.01.

Groups si-NC si-KLF12 si-NC+RhIL-6 si-KLF12+RhIL-6 F P CyclinD10.188±0.0220.096±0.0121）2）0.455±0.0431）2）0.205±0.02197.0880.000 Bcl-20.194±0.0230.072±0.0091）2）0.703±0.0681）2）0.305±0.0291）2）147.6770.000 Bax 0.296±0.0310.545±0.0561）2）0.055±0.0071）2）0.215±0.026103.9490.000

3 討論

宮頸癌發生發展是涉及多因素、多步驟、多基因的復雜過程，其發生發展的分子機制尚未明確[11］。近年研究發現，在女性生殖道內分泌腫瘤中KLF家族成員具有重要作用，研究顯示，子宮內膜癌中KLF6表達降低，無淋巴結轉移患者KLF6表達高于淋巴結轉移者，且腫瘤浸潤程度越高，KLF6表達越低[12］。宮頸癌中KLF4表達降低，隨臨床分期進展，其表達降低[13］。KLF12是KLF家族成員，在胃癌、胰腺癌等多種腫瘤中具有重要作用，但在宮頸癌中研究較少[14-15］。既往研究發現，宮頸癌中KLF12表達升高[6］，KLF12對宮頸癌細胞生物學特性及機制的影響尚未明確。為探究KLF12在宮頸癌中的作用，本研究首先檢測宮頸癌組織及不同宮頸癌細胞KLF12表達，結果顯示，宮頸癌細胞及組織中KLF12表達均明顯升高，與既往研究結果一致。由于宮頸癌C33A細胞中KLF12表達最高，因此選擇C33A細胞作為研究對象。

本研究顯示，KLF12特異性siRNA可明顯降低宮頸癌細胞增殖，促進其凋亡，下調p-STAT3、Cy‐clinD1和Bcl-2表達，上調Bax表達，且可減弱RhIL-6對p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2和Bax表 達 的 影 響。STAT3在細胞生長中有重要作用，與腫瘤發生發展密切相關[16-17］。正常細胞中，STAT3活化過程短暫，但在多種腫瘤細胞中，因細胞因子（如TNF-α、IL-6）、生長因子（如TGF-β、EGF）等失調，活化后的STAT3水平異常升高，可引起細胞增殖凋亡失衡，最終導致 腫 瘤 發 生[18-19］。增 殖 相 關 蛋 白（如Myc、Cy‐clinD1）、凋亡相關蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL）等是STAT3的重要靶基因產物，IL-6/STAT3信號異常激活引起的上述基因表達異常將引腫瘤[20］。IL-6是一種細胞因子，是IL家族成員，在調節免疫細胞、傳遞信息、炎癥反應、增殖和分化等過程中發揮重要作用[21-22］。提示抑制KLF12表達可能通過調控IL-6/STAT3信號途徑抑制宮頸癌細胞生長。

綜上所述，宮頸癌中KLF12表達升高，抑制其表達可降低癌細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與抑制IL-6/STAT3信號通路有關。本研究可能為研究KLF12在宮頸癌中的作用提供理論基礎，提示KLF12可能是宮頸癌診治的潛在靶標。