綠原酸緩解Aβ誘導的阿爾茨海默病小鼠神經損傷及NLRP3炎癥小體活化①

劉 帆 何 琴 王鴻利 黃 丹 楊文娟

（四川省醫學科學院·四川省人民醫院草堂病區老年內五科，成都610072）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種神經退行性疾病，主要表現為記憶、認知和行為衰退，最終導致死亡[1］。目前研究表明，AD 病理特點為胞外amyloid-β（Aβ）肽聚合，細胞內神經元纖維纏結和Tau 蛋白高度磷酸化[2］。Aβ 肽可以多種形式存在，如單體、低聚物或纖維狀。越來越多證據表明，AD 發病機制為低聚物形式的Aβ 肽在胞外聚集[3-4］。目前AD 治療藥物主要為乙酰膽堿酯酶抑制劑（acetylcholinesterase inhibitors，AChEIs）和n-甲基-d-天冬氨酸受體拮抗劑（N-methyl-D-aspartate，NMDA），但無法達到預期治療效果，且存在危及生命的潛在副作用[5-6］。中藥具有多成分、多靶點、多途徑特點，在AD 治療方面優于單靶點藥物[7-8］。綠原酸具有多種生物效應，包括抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗高血壓、抗肥胖等作用[9-11］。已有研究表明，綠原酸發揮神經保護作用的可能機制是通過抑制乙酰膽堿和丁酰膽堿活性，從而減緩腦內乙酰膽堿和丁酰膽堿破壞，防止氧化性神經退行性變[12］。因此，本文主要研究綠原酸對Aβ 誘導的AD神經損傷及NLRP3炎癥小體活化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性昆明小鼠（5～6 周齡）購于四川省醫學科學院，四川省人民醫院實驗動物研究所，許可證號：SCXK（川）2018-110。 22℃、50%相對濕度，12 h光/12 h暗循環飼養，自由飲食飲水，適應性喂養1周進行后續試驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 5-HT、5-HIAA、iNOS、IL-6和TNF-α 試劑盒購自南京建成生物研究所；BCA 試劑盒購自合肥萊爾生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自Promega 公司；所有抗體均購自上海艾博抗生物科技有限公司；綠原酸購自成都曼斯特生物有限公司；BX43 光學顯微鏡購自日本奧林巴斯；酶標儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。

1.2 方法

1.2.1 AD 小鼠模型建立及治療 參考文獻[13］制備低聚Aβ1-42溶液，PBS 溶解，使用前37℃孵化72 h。小鼠腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和二甲苯（20 mg/kg）進行麻醉。孵化72 h 后，采用1 L 漢密爾頓注射器將Aβ1-42注射于小鼠雙側大腦海馬體（1.0 L，0.1 L/min）構建AD 小鼠模型[14］。AD 小鼠隨機分為5 組：對照組、模型組、綠原酸低、中、高劑量治療組（20、50、100 mg/kg）[15］。模型建立第15 天口服給予小鼠綠原酸，連續21 d，對照組口服等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2.2 神經損傷評分 各組小鼠建模15 d 后進行神經損傷評分，具體參考Longa 神經評分法[16］。0 分：正常，無神經損傷；1 分：左側前爪不能完全伸展，輕度神經損傷；2 分：行走時，小鼠向癱瘓側轉圈，中度神經功能缺損；3 分：行走時，小鼠身體向癱瘓側傾倒，重度神經功能缺損；4 分：不能自發行走，有意識喪失[16］。

1.2.3 腦含水量檢測 采用干濕重法測定小鼠腦組織含水量：取小鼠腦組織約100 mg，稱重（濕重），110℃烘烤腦組織24 h 以上至恒重，稱重（干重）。腦組織含水量（%）=（濕重?干重）/濕重×100%[17］。

1.2.4 HE 染色 處死小鼠，分離腦組織，石蠟包埋，連續切片（4 μm），HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察小鼠海馬體。

1.2.5 Western blot 腦組織加入液氮研磨，裂解緩沖液裂解，4℃、14000 r/min 離心15 min，形成濃縮蛋白。取20 μg 總蛋白進行12%SDS-PAGE 凝膠電泳，轉至PVDF 膜，37℃下5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入抗神經營養因子（anti neurotrophinic factor，NGF）、NLRP3、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、ASC 和IL-1β 4℃過夜。TBST 洗滌（含Tween-20的Tris緩沖鹽水），加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（二抗）37℃反應1 h，洗膜，ECL曝光，Quantity one 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 ELISA 按照試劑說明書，測量血清中細胞因子5-HT、5-HIAA、iNOS、IL-6 和TNF-α 表達。Bio-Rad 酶標儀測定光密度。采用ELISA 試劑盒提供的細胞因子標準品建立標準曲線。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0 軟件進行統計學分析，數據以±s表示，多重性比較采用Duncan 法，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 綠原酸對Aβ 誘導的AD 小鼠神經損傷及腦含水量的影響 神經損傷評分結果表明，Aβ 誘導的AD 小鼠神經損傷評分為（2.73±0.40）分，綠原酸治療后，小鼠神經損傷程度顯著下調（P<0.05）。腦含水量檢測結果表明，Aβ 誘導的AD 小鼠腦含水量為（88.61±6.38）%，綠原酸治療后小鼠腦含水量顯著下調（P<0.05，圖1）。

圖1 小鼠神經損傷評分及腦含水量Fig.1 Neurologic deficit score and cerebral water content of mice

2.2 綠原酸對Aβ 誘導的AD 小鼠海馬體病理損傷的影響 HE 染色結果表明，模型組小鼠海馬體椎體細胞神經元萎縮，細胞空泡化，細胞疏松。綠原酸治療后，小鼠上述情況明顯緩解（圖2）。

圖2 HE染色觀察小鼠海馬體病理學變化（×400）Fig.2 Hippocampus pathology of mice detected by HE staining（×400）

2.3 綠原酸對Aβ 誘導的AD 小鼠BDNF、NGF、5-HT 和5-HIAA 表達的影響 Western blot 結果表明，模型組小鼠神經營養因子BDNF 和NGF 表達下調（P<0.05），綠原酸治療后，BDNF和NGF蛋白表達顯著上調（P<0.05）。ELISA 結果表明，模型組小鼠5-HT 和5-HIAA 表達顯著下調（P<0.05），綠原酸治療后，5-HT和5-HIAA表達上調（P<0.05，圖3）。

圖3 小鼠腦組織中BDNF、NGF、5-HT 和5-HIAA 蛋白表達Fig.3 Protein expressions of BDNF，NGF，5-HT and 5-HIAA in mice brain tissue

2.4 綠原酸對Aβ 誘導的AD 小鼠細胞因子的影響 ELISA 結果表明，模型組小鼠外周血中促炎因子iNOS、IL-6 和TNF-α 表達顯著上調（P<0.01），綠原酸治療后，外周血中促炎因子iNOS、IL-6和TNF-α表達下調（P<0.01，圖4）。

圖4 小鼠外周血細胞因子表達Fig.4 Cytokine expressions in peripheral blood of mice

2.5 綠原酸對Aβ誘導的AD 小鼠NLRP3炎癥小體活化的影響 Western blot 結果表明，模型組小鼠NLRP3、ASC 和IL-1β 表達顯著上調（P<0.05），綠原酸治療后，NLRP3、ASC 和IL-1β 蛋白表達顯著下調（P<0.05，圖5）。

圖5 小鼠腦組織中NLRP3、ASC和IL-1β蛋白表達Fig.5 Protein expressions of NLRP3，ASC and IL-1β in mice brain tissue

3 討論

AD 是一種復雜的神經退行性疾病。本研究采用綠原酸治療后，Aβ 誘導的AD 小鼠神經損傷程度顯著下調，腦含水量顯著下調。半邊花丁醇治療可改善AD 相關認知和行為障礙[18］。已有研究表明，綠原酸可通過阻止酒精誘導的大鼠嗜鉻細胞瘤PC12 細胞凋亡，從而提高細胞活力和促進細胞分化[19］。綠原酸可通過調節炎癥因子、缺氧因子和神經生長因子保護局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠[20］。綠原酸對腦缺血再灌注損傷大鼠具有神經保護作用，主要通過調節氧化應激相關的Nrf2 通路發揮作用[21］。研究表明，綠原酸可預防APP/PS2 轉基因AD 小鼠認知能力障礙并減少Aβ 斑塊沉積，說明綠原酸對腦組織具有保護作用[22］。

本研究中模型組小鼠神經營養因子BDNF 和NGF 蛋白表達顯著下調，綠原酸治療后BDNF 和NGF 蛋白表達顯著上調，同時模型組小鼠5-HT 和5-HIAA表達顯著下調，綠原酸治療后，5-HT和5-HIAA表達均上調。已有研究表明，AD中NGF和BDNF水平下降，尤其在AD 早期，這兩種神經細胞因子由于NGF 代謝改變和膽堿能突觸損失而缺失[23］。5-HT參與AD病理過程，AD患者血清中5-HT表達顯著下調[24］。5-HIAA可誘導腦啡肽酶改善AD小鼠記憶能力，促進內肽酶腦啡肽酶生成，從而緩解AD 癥狀[25］。本研究表明，綠原酸可促進BDNF、NGF、5-HT和5-HIAA上調，從而緩解AD小鼠癥狀。

炎癥反應是機體對外來傷害性刺激的一種防御反應，適度炎癥反應對機體起保護作用。但顱腦損傷等強烈刺激導致機體產生過量炎癥因子，炎癥反應級聯放大，甚至失控，破壞微環境穩定和機體平衡，導致細胞死亡和功能缺失，且可能長期存在慢性神經炎癥反應[26］。敲除AD 小鼠NLRP3可促進小膠質細胞抗炎作用，有利于小膠質細胞清除Aβ蛋白[27］。本研究中模型組促炎因子iNOS、IL-6 和TNF-α 表達顯著上調，綠原酸治療后，3 種促炎因子表達顯著下調。同時模型組NLRP3、ASC 和IL-1β表達顯著上調，綠原酸治療后，NLRP3、ASC 和IL-1β蛋白表達顯著下調。最近研究表明，炎癥可能與神經退行性癡呆有關。細胞免疫成分，如小膠質細胞或星形膠質細胞，可介導炎癥分子釋放，包括TNF、生長因子、黏附分子或趨化因子[28］。雖然炎癥在AD發病機制中的作用尚未明確，但IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子已被證實參與AD 發病機制。雖然免疫系統有助于保護大腦，但免疫分子失衡也可能在神經退行性疾病中發揮重要作用[29-30］。炎癥小體組成部分NLRP1、NLRP3、ASC 和caspase-1，以及下游效應器IL-1β 和IL-18 等在AD 患者mRNA 和蛋白水平均顯著上調[31］。Aβ 可激活小神經膠質細胞NLRP3炎癥小體的機理是Aβ 促進IL-1β 成熟，激活一系列炎癥活動。研究表明，NLRP3 炎癥小體缺失可誘導小膠質細胞向M2 表型轉變從而減少Aβ 在AD 模型中的沉積[32］。已有研究表明，急性肝損傷中綠原酸可抑制NLRP3 炎癥小體激活，降低Pro-caspase-1、caspase-1、Pro-IL-1β 和IL-1β 蛋白表達。此外，綠原酸還可降低血清和肝臟TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA表達，與本研究結果一致[33］。綠原酸可能通過降低焦慮相關神經遞質表達，改善咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠焦慮行為，抑制皮膚炎癥反應[34］。杜仲綠原酸通過抑制NF- κB P65 活化減弱LPS 誘導的HRECs 細胞凋亡和炎癥反應[35］。本研究表明，綠原酸可抑制Aβ 誘導的AD 炎癥反應，從而發揮神經保護作用。

綜上所述，本研究發現綠原酸可緩解Aβ 誘導的AD 小鼠神經損傷，抑制炎癥反應，激活NLRP3炎癥小體。本研究僅為體內試驗的初步探討，綠原酸具有AD 治療效果，為進一步研究綠原酸藥理學功能提供依據。