miR-124通過靶向Capn4抑制Wnt/β-catenin信號通路調節胃腸道間質瘤（GIST-T1）細胞生物學功能①

支小飛 陳思俊 華如衡 朱建偉（南通大學附屬醫院普外科，南通226001）

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是來源于胃腸道間充質干細胞最常見的間葉源性腫瘤，在消化道腫瘤中約占1%~3%，其主要在胃及小腸中發生［1-2］。可發生于各年齡段，絕大多數病例發生于成年人，但在兒童中也有報道，且多為惡性，男女GIST發病率沒有明顯差異［3-4］。microRNA是一種廣泛分布的內源性非編碼蛋白質的小RNAs（約為22個核苷酸），其特點是可以結合到mRNA的3'UTR端來發揮其負調控基因表達的作用［5］?，F已證實，miRNA與腫瘤的發生發展具有緊密的聯系［6］。

研究顯示，miRNA在胃腸道間質瘤中同樣存在著差異表達，多種miRNA參與胃腸道間質瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡等過程，表明miRNA在胃腸道間質瘤形成發展中扮演著重要角色［7-10］。miR-124也是被認可的miRNA家族中的成員之一，已有研究表明，miR-124在腫瘤性疾病、神經發生中表達有明顯異常，扮演著重要的調控角色［11-15］。但目前有關miR-124在胃腸道間質瘤中的表達情況及調控作用研究相當少，其具體作用機制仍然是不清楚的。本研究中通過實時熒光定量PCR檢測了miR-124在胃腸道間質瘤組織和細胞中的表達，并且進一步探討了miR-124對于GIST-T1細胞增殖、侵襲、凋亡的影響以及相關的分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 主要試劑細胞培養基DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶購自Sigma；Lipofectamine 2000轉染試劑和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自Invit‐rogen公司；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報告檢測試劑盒購自Promega公司；Capn4-3'UTR和Capn4-3'UTR MUT由擎科生物有限公司設計；miR-124 mimics及NC-mimics、miR-124 inhibitor及NC-in‐hibitor由上海吉瑪制藥公司設計并合成；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；Transwell孔板購自康寧；Capn4（ab93959，兔抗）購自Abcam；β-actin抗體（AA128，鼠抗）購自上海碧云天生物有限公司；胃腸道間質瘤細胞系（GIST-T1），貨號為QCB318購自上海欽誠生物科技有限公司。

1.1.2 臨床樣本選取來自南通大學附屬醫院胃腸外科實施外科手術切除，符合中國胃腸道間質瘤診斷標準的GIST臨床病例30例，依據生長部位分為：胃16例、腸道10例、胃腸外4例；依據腫瘤直徑分為：直徑≤2 cm 3例，直徑2.1~5.0 cm 10例，直徑5.1~10.0 cm 13例，直徑>10 cm 4例；根據GIST危險度分級分為：極低度危險性腫瘤3例，低度危險性腫瘤8例，中度危險性腫瘤12例，高度危險性腫瘤7例。其中男性17例，女性13例，患者年齡分布在17~58歲，平均年齡（45±10）歲，手術切除標本具有保存完整的腫瘤組織和切緣正常組織，分別選取腫瘤組織及切緣組織標本各30例，組織離體后液氮中進行凍存，并在使用前均經HE染色和免疫組化標記（CD117、CD34、SMA、Desmin4）進行鑒定。

1.2 方法

1.2.1 GIST-T1細胞培養與細胞轉染人胃腸道間質瘤細胞系（GIST-T1）使用含有10%FBS的DMEM培養基，在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養，每3 d進行1次換液。收集對數生長期的細胞接種于6孔板中，2×105個/孔。采用Lipofectamine 2000試劑根據說明書進行轉染。根據實驗設計，對細胞進行模擬物mimics和inhibitor處理，模擬物處理的細胞分為3組：空白對照組（NC組）、陰性對照組（mimics-NC組）和miR-124模擬物組（miR-124 mimics組）。In‐hibitor處理的細胞分為3組：空白對照組（NC組）、陰性對照組（inhibitor-NC組）和miR-124抑制劑組（miR-124 inhibitor組）。

1.2.2 實時熒光定量PCR根據TRIzol Reagent使用說明書提取組織及細胞中的總RNA。取100 ng的總RNA為模板，按照逆轉錄試劑盒使用說明書獲得cDNA。取cDNA和引物，按照實時熒光定量PCR檢測試劑盒說明書配制PCR反應體系，反應條件為：95℃預變性30 s，40個循環擴增反應（95℃5 s，60℃20 s）。U6為miR-124的內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-124的 相 對 表 達。miR-124 F：5'-GAGAATTCGCACGCGTCGCCAGCTTTTTC-3'，miR-124 R：5'-TCTCTAGATGCAGCTGCAGCGCTGAGATC-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3'，U6 R：5'-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3'。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖使用96孔板按照上述方法轉染GIST-T1細胞，并在標準空白孔中加入不含細胞的完全培養液，培養48 h后在每個孔中加入10 μl CCK-8試劑，于搖床上輕輕晃動混勻后，置于37℃培養箱避光培養1 h，然后使用酶標儀測定波長450 nm的吸光度值。

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移和侵襲遷移：轉染24 h后用胰酶消化各組細胞并使用無血清培養基重懸細胞，調整細胞密度為2×108個/L，取細胞懸液100 μl加在Transwell小室的上層，Transwell小室下層加入500 μl含10%血清培養基，置于培養箱中繼續培養24 h后取出小室，PBS清洗后使用棉簽輕輕擦去上室中未遷移的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清 洗3次 后 使 用0.1%結 晶 紫 染 色10 min，PBS清洗后隨機選取5個視野，計數下室染色細胞。侵襲：將凍存的Matrigel置于4℃冰箱直至液態，用400 μl無血清培養基稀釋50 μl Matrigel膠原液并混勻。向Transwell小室上室中加50 μl上述稀釋液，置于37℃培養箱中進行孵育直到凝固，然后加入100 μl無血清培養基浸潤凝膠，吸棄，后續步驟與遷移實驗相同。通過計數穿膜細胞的數目來反映細胞侵襲能力。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡轉染48 h后用不含EDTA的胰酶消化miR-124 mimics組、mimics-NC組、空白對照組細胞，用上清培養液終止消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞，使用500 μl 1×binding buffer重懸細胞，然后加入5 μl Annexin VFITC和10 μl PI，室溫避光5 min后流式細胞術統計各組的凋亡率。

1.2.6 通過生物信息學預測miR-124的靶基因通過生物信息學網站miRBD和Target Scan聯合預測miR-124的靶基因。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗取GIST-T1細胞制備成單細胞懸液，接種于96孔板，按照Lipo‐fectamine 2000試劑說明書進行共轉染，然后將細胞分為以下4組：①野生型質粒對照組（轉染mimics-NC和Capn4-3'UTR）；②野生型實驗組（轉染miR-124 mimics和Capn4-3'UTR）；③突變型質粒對照組（轉染mimics-NC和Capn4-3'UTR MUT）；④突變型質粒實驗組（轉染miR-124 mimics和Capn4-3'UTR MUT）。24 h后裂解細胞，并按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.2.8 Western blot檢測收集轉染后的GIST-T1細胞，進行裂解后提取細胞總蛋白質，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣量為20 μg，10%SDS-PAGE電泳實驗跑膠，以濕轉法電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，用1×PBST溶液清洗3次，然后加入一抗（Capn4抗體、β-actin抗體），4℃過夜孵育，洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL顯影液顯影。

1.3 統計學分析采用GRAPD prism 6統計學軟件進行分析，數據以±s表示，多組數據之間的比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組數據之間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-124在胃腸道間質瘤組織中具有低表達qRT-PCR檢測收集到的30例胃腸道間質瘤組織、癌旁組織中miR-124的表達情況，以U6作為內參，結果顯示miR-124在胃腸道間質瘤組織中的表達量顯著低于癌旁組織（P<0.01，圖1）。

圖1 qRT-PCR檢測miR-124在GIST組織、癌旁組織中的差異性表達Fig.1 Differential expression of miR-124 in GIST tissues and adjacent tissues by qRT-PCR

2.2 miR-124在GIST-T1細胞中過表達后檢測及細胞生物學功能檢測以胃腸道間質瘤（GIST-T1）細胞作為研究對象，在細胞中分別轉染miR-124 mimics、mimics-NC、miR-124 inhibitor、inhibitor-NC 48 h后，如圖2A所示，與mimics-NC組相比，miR-124 mimics組GIST-T1細胞中的miR-124表達顯著上調（P<0.01），mimics-NC組與空白對照組之間并沒有差異，而與inhibitor-NC組相比，miR-124 inhibi‐tor組GIST-T1細胞中的miR-124表達顯著下降（P<0.001）。提示轉染miR-124 mimics能明顯提高細胞中miR-124的表達水平，轉染效率高。

在細胞中分別轉染miR-124 mimics和mimics-NC 48 h后，CCK-8實驗結果顯示（如圖2B），與mim‐ics-NC組相比較，miR-124 mimics組細胞吸光度值明顯低于mimics-NC組（P<0.01），而mimics-NC組與空白對照組之間并無差異，說明上調miR-124表達能顯著降低GIST-T1細胞增殖。

在細胞中分別轉染miR-124 mimics和mimics-NC 48 h后，Transwell小室遷移實驗結果顯示（如圖2C），與mimics-NC組 相比 較，miR-124 mimics組GIST-T1細胞遷移數目明顯減少（P<0.01），mimics-NC組與空白對照組之間并無差異。說明上調miR-124表達能明顯抑制GIST-T1細胞遷移。此外，Transwell檢測細胞侵襲，顯示侵襲能力下降（如圖2D，P<0.05）。

在細胞中分別轉染miR-124 mimics和mimics-NC 48 h后，流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，結果如圖2E所示，與mimics-NC組相比較，miR-124 mimics組GIST-T1細胞的總凋亡率明顯增加（P<0.001），mimics-NC組與空白對照組之間并無差異。結果說明上調miR-124表達能明顯促進GIST-T1細胞發生凋亡。

圖2 miR-124表達對GIST-T1細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡能力的影響Fig.2 Effect of miR-124 expression on proliferation，mi?gration，invasion and apoptosis of GIST-T1 cells

2.3 miR-124的靶基因預測通過生物信息學在線分析網站miRanda及Targetscan進行聯合預測，并結合參考文獻［16］，預測Capn4可能是miR-124的靶基因，miR-124與Capn4 3'UTR區存在互補的結合位點（如圖3A）。進一步通過雙熒光素酶報告實驗檢測miR-124與Capn4 3'UTR的結合作用（如圖3B），結果顯示，miR-124能夠顯著性抑制GIST-T1細胞中Capn4 3'UTR區的熒光素酶活性（P<0.01），而miR-124對GIST-T1細胞中Capn4 3'UTR突變區的熒光素酶活性沒有明顯的抑制作用。說明miR-124可以與Capn4 3'UTR區進行特異性結合。

圖3 miR-124與Capn4靶向結合Fig.3 Targeted binding of miR-124 to Capn4

2.4 miR-124對Capn4基因的表達調控細胞分組同上，轉染48 h后，Western blot檢測miR-124過表達或者抑制后Capn4蛋白表達水平變化，結果如圖4所示，miR-124 mimics組中Capn4蛋白表達低于mimics-NC組及空白對照組（P<0.01），miR-124 in‐hibitor組中Capn4蛋白表達顯著高于inhibitor-NC組及空白對照組（P<0.001）。表明miR-124可以下調Capn4蛋白表達。

圖4 Western blot檢測GIST-T1細胞中Capn4蛋白表達Fig.4 Western blot was used to detect expression of Capn4 protein in GIST-T1 cells

2.5 miR-124對Wnt/β-catenin信號通路各蛋白表達的影響細胞分組同上，轉染48 h后，Western blot檢測miR-124過表達或者抑制后Wnt-1、βcatenin蛋白表達水平變化，結果如圖5所示，miR-124 mimics組中Wnt-1、β-catenin蛋白表達低于mimics-NC組及空白對照組（P<0.001），miR-124 inhibitor組中Wnt-1、β-catenin蛋白表達顯著高于inhibitor-NC組及空白對照組（P<0.001）。

圖5 Western blot檢測GIST-T1細胞中Wnt-1、β-catenin蛋白表達Fig.5 Protein expressions of Wnt-1，β-catenin were mea?sured by Western blot in GIST-T1 cells

3 討論

microRNA是一種高度保守的非編碼性小RNAs（約為22個核苷酸）。miRNA在腫瘤中具有差異性表達，在細胞的增殖、遷移、凋亡具有重要作用。miR-124也是其成員之一，在腫瘤發生發展中具有差異性表達，并扮演著重要的調控角色。ZHANG等［17］發現，非編碼RNA MALAT1與miR-124相互作用，并通過靶向JAG1調節舌癌生長。JIAO等［18］發現miR-124通過滅活Notch途徑促進神經元干細胞的增殖和分化。LI等［19］發現lncRNA MALAT1通過調節miR-124/STAT3促進非小細胞肺癌的發展。PAN等［20］研究發現慢病毒介導的miR-124過表達通過靶向JAG1和EZH2抑制胃癌的生長和侵襲。本研究使用qRT-PCR檢測胃腸道間質瘤組織和癌旁組織中miR-124的表達情況，發現miR-124在腸道間質瘤組織中的表達量顯著低于癌旁組織，說明miR-124確實與胃腸道間質瘤的發生有關。為了進一步研究miR-124對胃腸道間質瘤（GIST-T1）細胞增殖、遷移和凋亡的影響，本研究在體外條件下培養GIST-T1細胞，然后發現在細胞中轉染miR-124 mimics可以上調GIST-T1細胞miR-124的表達；CCK-8實驗結果顯示，上調miR-124表達能顯著性降低GIST-T1細胞增殖；Transwell遷移實驗結果顯示上調miR-124表達能明顯降低GIST-T1細胞遷移；Transwell小室侵襲實驗結果顯示上調miR-124表達能明顯抑制GIST-T1細胞侵襲，流式細胞術檢測結果說明上調miR-124表達能明顯促進GIST-T1細胞發生凋亡。進一步說明miR-124在胃腸道間質瘤細胞中具有重要作用，能夠抑制細胞發生惡性生物學行為。

目前，miR-124調控腫瘤發生的具體機制尚未明確。CHEN等［21］研究發現circHIPK3通過miR-124調節細胞增殖和遷移，并調節肝細胞癌中AQP3的表達。QIAN等［22］發現miR-124通過抑制整合素αV表達抑制人肝細胞癌遷移和侵襲。QIAO等［23］發現miR-124通過抑制AURKA抑制膠質母細胞瘤生長并增加化學敏感性。Capn4是鈣蛋白酶的一個亞基，現有研究表明其在黑色素瘤、鼻咽癌、肝細胞癌、肝內膽管癌和腎細胞癌中均表達上調，說明Capn4在腫瘤的發生發展過程中確實具有重要作用。WANG等［24］研究發現Capn4通過激活Wnt/βcatenin信號通路促進人黑色素瘤的上皮-間質轉化。ZHENG等［25］發現Capn4可通過NF-κB誘導的基質金屬蛋白酶2促進鼻咽癌轉移。CHENG等［26］發現Capn4通過增加MAPK7促進結直腸癌的增殖。

為了進一步研究miR-124調控胃腸道間質細胞瘤的具體機制，通過生物信息學預測Capn4可能是miR-124的靶基因，miR-124與Capn4 3'UTR區存在互補的結合位點。進一步通過雙熒光素酶報告實驗檢測發現miR-124能夠特異性結合Capn4 3'UTR，并通過Western blot檢測發現miR-124可以下調Capn4蛋白水平表達，充分證實miR-124與Capn4之間具有靶向關系。CAI等［16］也證實miR-124通過Capn4在體外抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲。

腫瘤細胞的遷移和侵襲受到多種途徑調節，如Wnt/β-catenin、NF-κB和EMT途徑。β-catenin影響許多細胞過程，包括細胞增殖、黏附等，其在腫瘤細胞中也有高表達［27-28］。β-catenin在多種癌癥中促進腫瘤進展和轉移，并且在胃腸道間質瘤中也具有重要作用［29-30］。本研究Western blot結果顯示miR-124可以下調Wnt-1、β-catenin蛋白表達，從而抑制了腫瘤的發生發展。

綜上所述，miR-124可能通過靶向Capn4的表達，進而抑制GIST-T1細胞的生長和遷移，并促進GIST-T1細胞的凋亡，因此有望成為治療胃腸道間質瘤的重要靶點，對胃腸道間質瘤的預防及治療具有一定意義。本研究尚未證實Capn4和β-catenin的抑制劑對GIST-T1細胞生物學行為的影響，后續將深入研究。