基于Nrf2/ARE信號通路探討辛伐他汀減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷的作用

錢 斌 尹小川 李小軍 陳 蔚 張 敏（昆明醫科大學第一附屬醫院藥劑科，昆明650032）

多種因素（如肺炎、機械暴擊、吸入有毒有害氣 體等）引發的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）導致肺泡上皮和肺部毛細血管內皮細胞異常凋亡是患者呼吸困難、低氧血癥等肺功能障礙的主要原因，如不能有效控制癥狀，將演變為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）甚至休克、多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）或 衰 竭（multiple organ failure，MODF）［1-2］。臨床常用藥物如地塞米松會加大ALI老年患者醫源性類固醇糖尿病風險，因此拓寬ALI用藥選擇具有重要意義。CHAMBERS等［3］指出，內皮組織異常細胞凋亡導致組織結構受損是ALI患者的主要病理學改變。高聰等［4］研究表明，抑制肺組織細胞凋亡可明顯改善ALI大鼠肺損傷。XU等［5］研究表明，大量無法及時清除的活性氧（reactive ox‐ygen species，ROS）是導致ALI大鼠肺組織內皮細胞凋亡的關鍵因子。信號通路核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）是機體內最重要的內源性抗氧化通路。研究證明，Nrf2/ARE通過調控抗氧化酶如血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）及轉運蛋白谷胱甘肽（glutathione，GSH）等表達清除細胞內ROS，抑制氧化應激，降低細胞凋亡率［6］。辛伐他汀作為一線調控血脂藥物，對心臟、動脈等有良好的保護作用。臨床研究發現，辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）合并肺動脈高壓具有良好療效，但辛伐他汀對ALI的作用研究鮮有報道［7］。本研究通過建立大鼠ALI模型，探討Nrf2/ARE對ALI大鼠肺組織的保護作用，為辛伐他汀臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級8~10周齡SD雄性大鼠40只，體重200~220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0011，按照我院實驗動物管理辦法，室溫下標準飼料、自由飲水、分籠（4籠）適應性飼養1周后用于后續實驗。本研究經我院實驗動物管理倫理委員會批準（2019-032）。

1.1.2 主要試劑與儀器辛伐他汀（20 mg，杭州默沙東制藥有限公司）；脂多糖（LPS，10 mg/只，Sigma公司，生產批號：L2880）；地塞米松（dexamethasone，DXMS，0.75 mg，廣東華南藥業集團有限公司）；Nrf2、HO-1抗體、兔抗磷酸GAPDH抗體（美國Santa公司）；Western blot試劑盒（德國Rebstock公司）；TUNEL染色試劑盒、DCFH-DA染色試劑盒（南京建成生物有限公司）；HE染色試劑盒（上海碧云天公司）；蛋白濃度測定試劑盒、DAB化學發光試劑盒（北京華夏遠洋科技有限公司）；LIOOS600T生物顯微鏡（日本尼康公司）；Bio-Rad凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；-80℃冰箱（德國維根斯公司）；Leica RM2135組織切片機（德國Leica公司）；高速低溫離心機（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 模型構建和分組處理適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為4組：正常組、模型組、辛伐他汀干預組（實驗組）、陽性對照藥地塞米松干預組（DXMS組），每組10只。實驗組、DXMS組大鼠分別腹腔注射1 ml辛伐他汀溶液（5 mg/kg）和1 ml DXMS溶液（5 mg/kg），正常組、模型組分別腹腔注射等量生理鹽水；腹腔注射30 min后，模型組、實驗組、DXMS組大鼠分別尾靜脈注射0.5 ml LPS（5 mg/kg）復制ALI模型［8］，正常組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2 肺組織濕重/干重（W/D）測定注射完畢后，所有大鼠正常飲食，自由飲水喂養4 h后斷頭處死大鼠，打開胸腔無菌取出其肺組織，肉眼觀察各組大鼠肺組織解剖病理變化；無菌清洗，無菌吸水紗布吸干，取各組大鼠肺組織（左肺下葉除外）-80℃備用。同時取各組大鼠左肺下葉，清洗血跡，稱重（濕重W），60℃連續烘干48 h，稱重（干重D），計算W/D。

1.2.3 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理學改變準確稱取50%各組大鼠左肺上葉組織，10%甲醛固定24 h，切片，HE染色，光鏡下觀察病理改變，根據肺泡內細胞浸潤、肺泡出血、肺泡間隔水腫及肺泡內纖維蛋白沉積4個方面進行評價，每只大鼠取4張切片，各切片選取6個不同視野進行評分，取平均值。評分標準：無病變或輕微病變記為0分；輕度病變記為1分；中度病變記為2分；重度病變記為3分；極重度病變記為4分［9］。由病理研究室2位經驗豐富的醫師分別對肺泡、肺泡腔、肺泡壁及肺部出血情況進行評分，各項評分總值即為大鼠肺組織的ALI總評分。

1.2.4 TUNEL染色檢測各組大鼠肺組織細胞凋亡取50%各組大鼠右中肺組織，常規方法固定，冰凍切片，二甲苯浸洗2次，梯度乙醇浸洗5 min，風干，3%過氧化氫-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，3 min/次，4℃預冷乙醇下操作：0.1%TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，3 min/次，加入TUNNEL反應混合液，加入封口膜暗濕盒中37℃反應1 h，PBS漂洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，熒光顯微鏡下觀察，每組切片選取6個不同視野，Image-Pro 6.2軟件處理圖像，統計分析細胞凋亡率。

1.2.5 DCFH-DA染色檢測ROS含量評估各組大鼠肺組織氧化應激反應取50%各組大鼠右中肺組織，10%多聚甲醛固定2 h，石蠟包埋，切片，10 μmol/L DCFH-DA染色2 h，熒光顯微鏡下拍照，隨機選取5個不重復區圖像，Image J1.41分析綠色熒光平均強度值，依次對每組樣本進行統計分析。按照各試劑盒說明書要求，采用MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒檢測肺組織中與氧化反應相關底物變化。

1.2.6 qRT-PCR檢測各組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、SOD和MDA基因表達準確稱取50%各組大鼠左肺上葉組織，加入細胞裂解液，常規提取總RNA，測定濃度［10］，以逆轉錄試劑盒為模板合成單鏈cDNA，PCR儀測量。各樣品設3個平行復孔，獨立測量3次。引物序列見表1。

表1 目的基因序列Tab.1 Sequence of target genes

1.2.7 免疫組化檢測各組大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達取50%各組大鼠右下肺組織，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，二甲苯和梯度乙醇脫蠟，緩沖液中修復2 h充分暴露抗原決定簇。3%過氧化氫浸泡，室溫孵育10 min，封閉，PBS沖洗3次，分別加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標記的二抗室溫孵育30 min，清洗，DAB顯色2~5 min至顯微鏡下觀察到棕黃色顆粒，去離子水終止反應（DAB顯色劑現用現配，避光保存）［11］。蘇木素輕度復染1.5~2 min，清洗，梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡，干燥，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并記錄，分析圖像。

1.2.8 Western blot檢測各組大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達取50%各組大鼠右下肺組織，加入組織裂解液裂解，冰浴5 min，離心，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度［12］，凝膠電泳分離蛋白，轉PVDF膜，5%TBST液中室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶1 000）4℃反應過夜，次日沖洗干凈，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育，ECL顯色，以GAPDH為內參，E-Gel Imager凝膠成像儀檢測，計算目的蛋白相對表達。

1.3 統計學分析采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，采用Graphpad5.01軟件作圖，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織W/D比較與正常組大鼠相比，模型組大鼠肺組織W/D明顯升高（P<0.05），與模型組相比，實驗組、DXMS組大鼠肺組織W/D明顯降低（P<0.05），實驗組和DXMS組差異無統計學意義（P>0.05，圖1）。

圖1 各組大鼠肺組織W/DFig.1 W/D of lung tissue of rats in each group

2.2 各組大鼠肺組織解剖學及病理學比較正常組大鼠肺組織表面光滑、飽滿富有彈性，呈粉紅色，肺組織表面無出血點，無斑點，被膜無緊張，切面無滲出，模型組大鼠肺組織表面皺縮嚴重，呈紅褐色，取出肺組織時有泡沫樣黏液流出，肺組織明顯腫大，肺組織表面有片狀淤血，出血點較多，同時被膜明顯僵硬，切面有滲出，實驗組、DXMS組大鼠肺組織較模型組有明顯好轉，雖見水腫，但出血點和淤血區域明顯減少（圖2A）。HE染色結果顯示，正常組大鼠肺組織結構完整，無充血、擴張及出血現象，肺泡腔結構清晰，肺泡壁厚度均勻，無增寬、滲出等現象，肺泡間隔及各級支氣管管腔內均未見水腫、炎癥細胞浸潤、分泌物滲出等。和正常組相比，模型組大鼠肺組織肺泡腔明顯變小，厚度不均一，間隔明顯增寬，腔內大量炎癥細胞填充，肺泡壁充血嚴重，支氣管及周圍毛細血管存在大量炎癥細胞浸潤，管腔有滲出血細胞、炎癥細胞和其他分泌物填充，ALI病理評分明顯升高（P<0.05），實驗組、DXMS組大鼠肺組織病理癥狀有所緩解，肺泡大小均一，腔內少量水腫液填充，炎癥細胞明顯減少，肺泡周圍毛細血管基本無擴張、充血現象，ALI病理評分明顯降低（P<0.05），實驗組和DXMS組差異無統計學意義（P>0.05，圖2B）。

圖2 各組肺組織解剖學及病理學變化Fig.2 Anatomical changes and pathology changes of lung tissue in each group

2.3 TUNEL染色檢測各組大鼠肺組織細胞凋亡TUNEL染色結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織細胞凋亡率明顯升高（P<0.05），與模型組相比，藥物干預后，實驗組、DXMS組大鼠肺組織細胞凋亡率明顯降低（P<0.05），實驗組和DXMS組差異無統計學意義（P>0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠肺組織細胞凋亡情況Fig.3 Cell apoptosis of lung tissue of rats in each group

2.4 DCFH-DA染色檢測ROS含量評估各組大鼠肺組織氧化應激反應DCFH-DA染色結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織綠色熒光強度明顯增強，ROS含量明顯增多（P<0.05），與模型組相比，藥物干預后，實驗組、DXMS組大鼠肺組織綠色熒光強度明顯減弱，ROS含量明顯降低（P<0.05）；采用試劑盒檢測氧化應激反應相關底物和酶活性，結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織細胞MDA含量明顯增加，而SOD酶活性明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，藥物干預后，實驗組、DXMS組大鼠肺組織細胞MDA含量明顯降低，SOD酶活性明顯增強（P<0.05）；實驗組和DXMS組差異無統計學意義（P>0.05，圖4）。

圖4 各組大鼠肺組織氧化應激比較Fig.4 Comparison of oxidative stress in lung tissue of rats in each group

2.5 qRT-PCR檢測各組大鼠肺組織中Nrf2、HO-1、SOD和MDA基因表達qRT-PCR結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、MDA mRNA表達明顯升高（P<0.05），SOD mRNA表達明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，實驗組和DXMS組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、SOD mRNA表達明顯升高（P<0.05），MDA mRNA表達明顯降低（P<0.05）；實驗組和DXMS組差異無統計學意義（P>0.05，圖5）。

圖5 各組大鼠肺組織中Nrf2、HO-1、SOD、MDA mRNA表達Fig.5 Nrf2，HO-1，SOD，MDA mRNA expressions in lung tissue of rats in each group

2.6 免疫組化及Western blot檢測各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1表達免疫組化及Western blot結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達明顯升高（P<0.05），與模型組相比，實驗組和DXMS組大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達明顯升高（P<0.05），實驗組和DXMS組差異無統計學意義（P>0.05，圖6）。

圖6 各組肺組織中Nrf2、HO-1表達Fig.6 Nrf2 and HO-1 expressions in lung tissue of rats in each group

3 討論

革蘭氏陰性菌LPS主要成分內毒素引發的機體感染中，肺臟是主要靶器官，ALI是最常見的肺損傷癥狀，其病理癥狀為肺部毛細內皮細胞大量凋亡導致血管通透性增強，ROS過度生成，氧化應激異常活躍，導致肺間質和肺泡水腫，肺組織結構破壞嚴重，呼吸窘迫等，如未及時緩解，可能危及患者生命［12］。因此需要尋找有效手段以控制ALI時的氧化應激，及時清除聚集的ROS，抑制肺組織細胞凋亡，保障ALI患者生命安全。

常用藥物地塞米松對ALI伴有心力衰竭、高血壓等心臟疾病的老年患者療效有限，且可能增加患者醫源性類固醇性糖尿病風險。作為一線降血脂藥物，辛伐他汀在心血管疾病臨床治療中，患者耐受性好，不良反應較輕微且呈一過性。研究表明，辛伐他汀可明顯抑制炎癥因子釋放，抑制血小板聚集，發揮抗凝血、改善血管內皮功能、抗氧化和免疫調節等作用［13］。SOHN等［14］研究證實，辛伐他汀可有效抑制氧化應激，在缺血性脊髓損傷動物模型中抑制細胞異常凋亡。MEDEIROS等［15］研究發現，辛伐他汀對膿毒癥引起細胞凋亡導致的小鼠休克療效較好。宋海剛等［16］研究發現，長期服用辛伐他汀可明顯減輕由機械通氣引發的氧化-抗氧化失衡，減輕呼吸機相關性肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）小鼠肺組織損傷。JIANG等［17］研究證明，改變辛伐他汀劑型可明顯增強辛伐他汀對ALI的治療效果。本研究通過構建ALI大鼠模型，發現與模型組相比，實驗組大鼠ALI肺組織病理特征明顯改善，肺組織細胞凋亡率明顯降低，證明了辛伐他汀對ALI的治療作用。

Nrf2/ARE是機體內最重要的內源性抗氧化信號通路。Nrf2是心血管系統、腎、肝、肺等組織中廣泛存在的一種調控因子，正常生理狀態下，Nrf2通過氫鍵與伴侶分子耦合以復合物形式在細胞質中穩定存在，細胞氧化應激時，氫鍵斷裂，大量Nrf2游離，與ARE結合，誘導靶基因增強HO-1等抗氧化酶表達，清除ROS，進行抗氧化應激，維持細胞正常結構［18］。研究顯示，多種呼吸系統疾病如急慢性肺損傷、COPD、肺纖維化等中，Nrf2/ARE通路發揮重要保護作用［19］。LONDON JR等［20］研究表明，Nrf-2基因缺失可減少抗氧化酶，導致小鼠感染多種肺疾病。陸元蘭等［21］研究證實，Nrf2在百草枯致大鼠急性肺損傷中發揮保護作用。本研究檢測各組大鼠氧化應激結果發現，與模型組相比，實驗組大鼠肺組織中ROS、MDA含量明顯降低，SOD活性明顯增強，氧化應激明顯受阻，而免疫組化及Western blot檢測結果顯示，實驗組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1表達較模型組顯著提高，推測辛伐他汀可能通過激活Nrf2/ARE通路發揮作用。

綜上所述，辛伐他汀可保護ALI大鼠肺組織，可能通過激活Nrf2/ARE通路，增強Nrf2和HO-1表達，抗氧化，抑制細胞凋亡實現，但其是否通過其他通路影響ALI進程需進一步研究。