骨髓間充質干細胞通過調控miR-142-3p保護LPS誘導大鼠肺上皮細胞RLE-6TN的炎癥損傷與凋亡①

鄒麗絹 李磊 肖政 許美霞 許濤

（武漢市第四醫院，華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院，武漢430033）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，AR‐DS）是一種以肺部炎癥迅速發作為特征的呼吸衰竭，是常見的臨床急癥［1］。ALI/ARDS的臨床特征主要有肺泡毛細血管屏障損傷、白細胞聚集、肺水腫、炎癥和肺泡出血等［2-3］。ALI/ARDS的發病率和死亡率都很高，雖然對這些疾病的病理生理學有較為深入的了解，但仍無有效藥物用于提高ALI/ARDS患者的生存率，而抑制肺部劇烈的炎癥反應是防治ALI/ARDS的潛在策略［4］。

間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有自我更新、分化和分泌細胞因子等功能，研究發現骨髓、脂肪、肺組織MSC移植可減輕脂多糖（lipo‐polysaccharide，LPS）誘導的ARDS大鼠肺損傷，改善肺功能，且骨髓、脂肪、肺組織MSC與LPS誘導的巨噬細胞共培養，可調節巨噬細胞分泌細胞因子［5］。研究發現，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesen‐chymal stem cells，BMSCs）移植處理ALI大鼠后，多種miRNA的表達出現異常，其中miR-142-3p表達水平顯著低于ALI模型組［6］。但BMSCs調控miR-142-3p在ALI/ARDS中的具體作用尚未明確，本研究采用LPS誘導大鼠肺上皮細胞RLE-6TN制備肺上皮細胞損傷模型，與不同比例BMSCs共培養，檢測細胞炎癥因子及凋亡水平，以期為BMSCs治療ALI/ARDS提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠肺上皮細胞RLE-6TN來源于美國ATCC細胞庫；大鼠BMSCs來源于中國科學院細胞庫。RPMI1640、DMEM/F12購自美國Hyclone；胎牛血清購自美國Gibco；LPS購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TRIzol購自美國Ambion；反轉錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；抗熒光衰減封片劑（含DAPI）、封閉液、Triton X-100、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜和化學發光試劑購自美國Milli‐pore；兔抗鼠NF-κB p65抗體、山羊抗兔二抗（免疫組化）、兔抗鼠Bcl-2抗體、兔抗鼠caspase-3抗體、兔抗鼠GAPDH、山羊抗兔IgG購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養將凍存的RLE-6TN細胞從液氮罐中取出，37℃水浴至凍存液溶解，將細胞懸液轉移至離心管，400 g離心3 min。棄上清，加入1 ml培養液重懸細胞沉淀，將細胞懸液轉移至培養瓶中，加入4 ml含10%胎牛血清的RPMI1640，于37℃、5%CO2培養箱內培養。大鼠BMSCs采用DMEM/F12，于37℃、5%CO2培養箱內培養。

1.2.2 CCK8法篩選LPS誘導時間及濃度收集對數期的RLE-6TN細胞，調整細胞密度并分布于96孔板中，每孔180 μl，約5×103個細胞。培養至細胞貼壁，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml LPS干預細胞，繼續培養12 h、24 h、48 h。每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續培養4 h，在酶標儀上檢測450 nm處吸光值。

1.2.3 qPCR檢測細胞miR-142-3p表達水平TRIzol裂解細胞，提取RNA，反轉錄合成cDNA，進行實時熒光定量PCR擴增，miR-142-3p引物合成由武漢天一輝遠生物科技有限公司完成，引物序列：miR-142-3p-F 5'-GGGTGTAGTGTTTCCTAC-3'，miR-142-3p-R 5'-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；U6-F 5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，U6-R 5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。反 應 程 序：95℃3 min；95℃5 s；56℃10 s；72℃25 s；40個循環。以2-??Ct法計算miR-142-3p相對表達量。

1.2.4 實驗分組與共培養處理將RLE-6TN細胞分為6組：對照組、LPS組、BMSCs培養液（DMEM/F12）組、RLE-6TN+BMSCs 1組（RLE-6TN∶BMSCs=10∶2）、RLE-6TN+BMSCs 2組（RLE-6TN∶BMSCs=10∶3）和RLE-6TN+BMSCs 3組（RLE-6TN∶BMSCs=10∶4）。RLE-6TN+BMSCs組均將RLE-6TN與BM‐SCs共培養，具體步驟如下：收集經2 μg/ml LPS處理48 h后的RLE-6TN細胞，更換為新鮮RPMI1640培養基，分布于6孔Transwell小室下層，每孔2 ml，約3×105個細胞。Transwell小室上層分別加入相應比例BMSCs，共培養24 h后，取出下室中的RLE-6TN細胞進行實驗檢測。

1.2.5 流式檢測細胞凋亡收集1.2.4中的各組RLE-6TN細胞，取約1×106個細胞，400 g離心5 min，棄上清液。向細胞沉淀中加入1 ml預冷PBS，混勻，400 g離心5 min，棄上清液。加入200 μl預冷PBS重懸細胞沉淀，依此加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，混勻，避光孵育30 min。流式細胞儀上機檢測各組細胞凋亡水平。

1.2.6 qPCR檢測細胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達水平收集1.2.4中的各組RLE-6TN細胞，實驗操作同1.2.3節，引物如下：IL-6-F 5'-CCTTCTTGGGACTGATGT-3'，IL-6-R 5'-ACTGGTCTGTTGTGGGTG-3'；TNF-α-F 5'-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3'，TNF-α-R 5'-GCTACGGGCTTGTCACTC-3'。

1.2.7 Western blot檢測細胞Bcl-2和caspase-3蛋白表達水平收集1.2.4中的各組RLE-6TN細胞，約1×106個細胞，加入200 μl RIPA裂解液于4℃裂解細胞，提取細胞總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定所提蛋白濃度，取20 μg蛋白進行SDS-PAGE分離。將蛋白轉移至PVDF膜，封閉2 h后，加入一抗（Bcl-2、caspase-3、GAPDH，稀釋比1∶1 000）孵育1 h，洗膜，二抗（稀釋比1∶20 000）孵育1 h。加入化學發光試劑，曝光顯影，記錄灰度值計算蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理所有檢測均進行3次重復，采用SPSS23.0軟件進行統計分析，計量資料采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS誘導時間及濃度篩選結果結果顯示，隨著LPS誘導時間延長及濃度的升高，對RLE-6TN細胞增殖活性的抑制作用越明顯，見圖1。因此，基于本研究檢測的時間點和濃度中，選擇對細胞損傷最為明顯的2 μg/ml LPS處理48 h作為后續實驗中LPS的處理濃度與時間。

圖1 CCK8檢測RLE-6TN細胞增殖活性Fig.1 Proliferation activity of RLE-6TN cells was detected by CCK8

2.2 LPS誘導對RLE-6TN細胞miR-142-3p表達的影響結果顯示，與對照組比較，LPS誘導組RLE-6TN細胞中miR-142-3p表達水平顯著升高（P<0.05），見圖2。

圖2 qPCR檢測RLE-6TN細胞中miR-142-3p表達水平Fig.2 Expression level of miR-142-3p in RLE-6TN cells was detected by qPCR

2.3 BMSCs共培養抑制RLE-6TN細胞凋亡結果顯示，與對照組比較，LPS組RLE-6TN細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，BMSCs培養液組細胞凋亡率差異無統計學意義（P>0.05），而BMSCs共培養組的RLE-6TN細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），且隨著共培養BMSCs比例的增加，細胞凋亡率逐漸降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 流式檢測RLE-6TN細胞凋亡Fig.3 Apoptosis of RLE-6TN cells was detected by flow cytometry

2.4 BMSCs共培養抑制RLE-6TN細胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA的表達結果顯示，與對照組比較，LPS組RLE-6TN細胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，BMSCs培養液組細胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達水平差異無統計學意義（P>0.05），而BMSCs共 培 養組 的RLE-6TN細胞miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05），且隨著共培養BMSCs比例的增加，表達水平逐漸降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 qPCR檢 測RLE-6TN細 胞 中miR-142-3p、IL-6及TNF-α mRNA表達水平Fig.4 Expression levels of miR-142-3p，IL-6 and TNF-α mRNA were detected by qPCR

2.5 BMSCs共培養影響RLE-6TN細胞Bcl-2和cas‐pase-3蛋白表達水平結果顯示，與對照組比較，LPS組RLE-6TN細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），caspase-3蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，BMSCs培養液組細胞Bcl-2和caspase-3蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05），而BMSCs共培養組的RLE-6TN細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），且隨著共培養BMSCs比例的增加，Bcl-2和caspase-3蛋白表達變化越顯著（P<0.05）。見圖5。

圖5 Western blot檢測RLE-6TN細胞Bcl-2和caspase-3蛋白表達水平Fig.5 Protein expression levels of Bcl-2 and caspase-3 were detected by Western blot

3 討論

ALI/ARDS屬于高度難治性疾病，其在肺上皮細胞中的復雜病理機制尚不完全明確。內皮細胞功能障礙和炎癥因子的過度釋放是肺泡毛細血管膜損傷的關鍵，而肺泡毛細血管膜損傷則是內毒素性肺損傷的典型特征［7］。LPS可直接或間接引起ALI/ARDS，常用于體內外復制ALI/ARDS模型［8］。肺內炎癥細胞失控性地釋放炎癥因子，是引發ALI的根本原因［9］。ALI/ARDS患者血清中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著高于健康人群，采用LPS誘導小鼠和A549細胞，也可檢測到高表達的促炎細胞因子［10］。miRNA參與了多種細胞生理病理過程的調節，包括內皮細胞損傷和炎癥反應。研究發現，LPS誘導人肺微血管內皮細胞HPMECs，可介導miR-92a表達上調，而抑制miR-92a可改善內皮細胞功能障礙，減少促炎因子IL-6和TNF-α的釋放［11］。miR-142因其在調節免疫應答方面的典型作用而受到廣泛關注［12］，本研究采用LPS誘導大鼠肺上皮細胞RLE-6TN，發現細胞中miR-142-3p表達上調，提示miR-142-3p異常表達可能與ALI/ARDS的發生發展存在一定聯系。

目前，對于ALI/ARDS尚無有效的特異性治療方法，而MSC在ALI/ARDS患者中具有良好的治療潛力，基礎研究結果也顯示BMSCs對LPS誘導的ALI可發揮較好的保護作用［13］。各類MSC治療ALI/ARDS的效果以及作用機制不盡相同，其作用機制大致可分為兩大類：一是直接通過遷移歸巢和定向分化在損傷部位發揮作用；二是通過旁分泌方式調節細胞炎癥因子水平，發揮免疫調節作用［14］。LPS誘導ALI大鼠，導致部分miRNA（包括miR-142-3p）表達異常，在BMSCs治療后，miRNA表達得到恢復，而失調的miRNA參與了BMSCs介導的免疫調節過程［6］。miR-142-3p為MSCs通過旁分泌信號調節免疫應答的關鍵性miRNA之一［15］。本研究結果顯示，經BMSCs共培養處理的RLE-6TN細胞中，LPS誘導致使表達上調的miR-142-3p、促炎因子IL-6和TNF-α均表達減少，提示BMSCs可能通過抑制miR-142-3p表達緩解RLE-6TN細胞炎癥反應。

肺上皮細胞凋亡可加速ALI/ARDS進展，是ALI/ARDS患者死亡的主要原因之一，LPS誘導肺泡上皮細胞可誘導炎癥反應與細胞凋亡［16］。對肺上皮細胞凋亡途徑進行調控，減少細胞凋亡，是ALI/ARDS治療的主要方向之一［17］。研究發現，miR-142-3p對腫瘤細胞、血管內皮細胞凋亡均具有調控作用［18-19］。本研究結果顯示，LPS誘導RLE-6TN細胞后，細胞凋亡率顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而凋亡執行因子caspase-3表達升高，經過BMSCs共培養的RLE-6TN細胞，凋亡率下降，Bcl-2表達升高，caspase-3表達降低，且共培養的BMSCs比例越高，效果越明顯。

綜上所述，LPS誘導大鼠肺上皮細胞RLE-6TN，可介導miR-142-3p、細胞促炎因子表達升高，細胞凋亡增加，而RLE-6TN細胞與BMSCs共培養后，緩解炎癥反應，減少細胞凋亡，其作用機制可能與抑制miR-142-3p的表達有關。