LncRNA DANCR靶向miR-423-5p調控ox-LDL誘導的血管內皮細胞凋亡、炎癥反應①

李騫 李秀研 林麗麗 許景芬 陳芬

（福建醫科大學附屬泉州第一醫院全科醫學科，泉州362000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種由多種危險因素引起的慢性炎癥性血管疾病，是全球范圍內死亡率和發病率升高的主要原因［1］。內皮細胞在血管功能中發揮重要作用，其功能障礙被認為是AS發生的重要標志。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）是誘導內皮細胞損傷的關鍵因子，可刺激內皮細胞炎癥反應和氧化應激，增加細胞凋亡，破壞細胞功能，進而促進AS發生發展［2］。因此，抑制ox-LDL誘導的內皮細胞損傷對防治AS意義重大。長鏈非編碼RNA（long non-cod‐ing RNA，LncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，其通過在轉錄后、轉錄和染色質水平上調控基因表達，參與調控內皮細胞功能障礙、膽固醇積聚、炎癥等病理過程，與AS進展密切相關［3］。分化拮抗非蛋白編碼RNA（differentiation antagonis‐tic non-protein coding RNA，DANCR）是一種腫瘤相關lncRNA，包括肝癌、乳腺癌和肺癌在內的多種惡性腫瘤中DANCR表達失調，其異常表達有助于癌細胞的增殖、遷移和侵襲，是一種潛在的癌癥標志物和治療靶點［4-5］。此外，DANCR還可提高腎小管上皮細胞活力，抑制脂多糖誘導的炎癥反應和凋亡［6］。然而，XIST介導AS進展的潛在機制仍不清楚。本研究采用ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）模擬AS細胞損傷，重點探討LncRNA DANCR對ox-LDL誘導的HUVEC凋亡和炎癥因子分泌的作用，分析其潛在靶基因，以期為AS治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料HUVEC購于中國典型培養物保藏中心；DMEM培養基、胎牛血清購于美國Sigma公司；一步法PCR逆轉錄試劑盒、微小RNA（microRNA，miRNA）逆轉錄試劑盒、SYBR Green master Mix購于北京天根生化科技有限公司；miRNA模擬物（miR‐NA mimics）、miRNA抑制物（anti-miR）、過表達載體（pcDNA-RNA）、小干擾RNA（si-RNA）、雙熒光素酶報告基因載體由上海生工公司提供；ox-LDL、Trizol試劑、細胞計數試劑盒（cell counting kit 8，CCK-8）、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin VFITC/PI）凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司；細胞周期素D1（CyclinD1）小鼠單克隆抗體、活化型半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）兔單克隆抗體、β-actin兔單克隆抗體、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG購于上海碧云天生物公司；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒購于上海冠導生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC體外損傷模型建立用含10%胎牛血清的DMEM培養基置于含5%CO2、37℃恒溫細胞培養箱中培養HUVEC，然后用含50 mg/L ox-LDL的細胞培養液處理細胞24 h構建體外損傷模型，模擬HUVEC AS損傷，記為OX-LDL組，同時設置正常對照（normal control，NC）組［7］。

1.2.2 細胞轉染和實驗分組將對數期HUVEC接種于6孔板，利用脂質體轉染法分別將pcDNA-con、pcDNA-DANCR、anti-miR-con、anti-miR-423-5p、pcD‐NA-DANCR+miR-con、pcDNA-DANCR+miR-423-5p mimics分別轉染HUVEC，轉染成功后用含50 mg/L ox-LDL的細胞培養液處理細胞24 h，依次命名為ox-LDL+pcDNA-con組、ox-LDL+pcDNA-DANCR組、ox-LDL+anti-miR-con組、ox-LDL+anti-miR-423-5p組、ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-con組、ox-LDL+pcDNADANCR+miR-423-5p組。

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測Ln‐cRNA DANCR和miR-423-5p表達按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，測定濃度和純度后-20℃保存備用。取適量的總RNA，分別使用一步法PCR逆轉錄試劑盒或miRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，用SYBR Green master Mix進行RT-qPCR擴增。具體引物如下（5'-3'）：DANCR上游引物CTGCATTCCTGAACCGTTATCT，DANCR下游引物GGGTG‐TAATCCACGTTTCTCAT；β-actin上游引物CCAACCGCGAGAAGATGA，β-actin下游引物CCAGAGGC‐GTACAGGGATAG；miR-423-5p上游引物ATGGTTC‐GTGGGTGA，miR-423-5p下 游 引 物GTGCAGGGTCCGAGGT；U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，U6下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT。2-ΔΔCt法計算LncRNA DANCR（內參為β-actin）和miR-423-5p（內參為U6）相對表達量。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力收集各組細胞，按照100 μl/孔、5×103個/孔接種于96孔板，24 h后每孔加入10 μl的CCK-8溶液，培養箱繼續孵育2.5 h，酶標儀檢測450 nm波長處每孔的吸光度（A）值。細胞存活率（%）=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡收集各組細胞，結合緩沖液調整為1×108個/L的單細胞懸液。取100 μl細胞懸液，按照Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒分別加入Annexin V-FITC和PI，室溫條件下暗室孵育15 min，補加結合緩沖液至總體積為500 μl，流式細胞術檢測細胞凋亡。

1.2.6 Western blot檢 測CyclinD1、Cleaved-cas‐pase-3蛋白表達水平放射免疫沉淀緩沖液提取各組細胞的總蛋白。蛋白定量后取適量蛋白和等體積上樣緩沖液混合，煮沸5 min使蛋白變性冷卻至室溫后備用。按照每泳道30 μg蛋白上樣，100 V 90 min進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。快速蛋白濕轉移將蛋白轉移至硝酸纖維素膜后，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫孵育2 h。用稀釋的CyclinD1抗體（1∶200）、Cleaved-caspase-3抗體（1∶1 000）、β-actin抗體（1∶1 000）溶液孵育室溫孵育膜2 h。用稀釋的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG溶液（1∶1 000）室溫孵育膜1 h。用化學發光顯色試劑盒進行顯影。曝光后，Image J1.8.0軟件檢測每個條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗將含有miR-423-5p結合位點的LncRNA DANCR野生（WT）序列或突變（MUT）序列克隆到雙熒光素酶報告質粒，構建雙熒光素酶報告基因載體WT-LncRNA DANCR、MUT-LncRNA DANCR。利用脂質體轉染法將WTLncRNA DANCR、MUT-LncRNA DANCR分 別 與miR-con或miR-423-5p mimics共 轉 染 至HUVEC，48 h后檢測細胞相對熒光素酶活性。同時將pc-DNA-con、pcDNA-DANCR、si-con、si-DANCR分別轉染HUVEC，48 h后RT-qPCR檢測miR-423-5p表達水平。

1.2.8 ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α分 泌水平收集各組細胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書步驟分別檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.3 統計學分析每組設置3個平行實驗，重復3次，所有計量資料符合正態分布，用±s表示。采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組件多重比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ox-LDL處理HUVEC中LncRNA DANCR、miR-423-5p的表達情況與NC組比較，ox-LDL組HU‐VEC中LncRNA DANCR的表達水平顯著降低，miR-423-5p表達水平顯著升高（P<0.05）。見表1。

表1 HUVEC中LncRNA DANCR和miR-423-5p表 達 量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of LncRNA DANCR and miR-423-5p in HUVEC（±s，n=9）

表1 HUVEC中LncRNA DANCR和miR-423-5p表 達 量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of LncRNA DANCR and miR-423-5p in HUVEC（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P<0.05.

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2.2 過表達DANCR對ox-LDL誘導的HUVEC增殖和凋亡的影響與NC組比較，ox-LDL組HUVEC中LncRNA DANCR表達顯著降低，細胞存活率、Cy‐clinD1蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率、Cleaved-cas‐pase-3蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與ox-LDL+pcDNA-con組比較，ox-LDL+pcDNA-DANCR組HU‐VEC中LncRNA DANCR表達顯著升高，細胞存活率、CyclinD1蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低（P<0.05）。見圖1、表2。

表2 過表達DANCR對ox-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC cells（±s，n=9）

表2 過表達DANCR對ox-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P<0.05；compared with ox-LDL+pcDNA-con，2）P<0.05.

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圖1 過表達DANCR對ox-LDL誘導的HUVEC增殖和凋亡的影響Fig.1 Effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC

2.3 抑 制miR-423-5p對ox-LDL誘導 的HUVEC增殖和凋亡的影響與ox-LDL+anti-miR-con組比較，ox-LDL+anti-miR-423-5p組HUVEC中miR-423-5p表達顯著降低，細胞存活率、CyclinD1蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低（P<0.05）。見表3、圖2。

圖2 抑制miR-423-5p表達對ox-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-423-5p inhibition on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC cells

表3 抑制miR-423-5p表達對ox-LDL誘導的HUVEC增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-423-5p inhibition on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC（±s，n=9）

表3 抑制miR-423-5p表達對ox-LDL誘導的HUVEC增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-423-5p inhibition on proliferation and apoptosis of ox-LDL-induced HUVEC（±s，n=9）

Note：Compared with ox-LDL+anti-miR-con，1）P<0.05.

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2.4 LncRNA DANCR靶向miR-423-5p LncRNA DANCR與miR-423-5p之間存在特異性互補結合位點，見圖3。與miR-con和WT-LncRNA DANCR共轉染比較，miR-423-5p mimics和WT-LncRNA DANCR共轉染后HUVEC相對熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；與miR-con和MUT-LncRNA DANCR共轉染比較，miR-423-5p mimics和MUT-LncRNA DANCR共轉染后HUVEC相對熒光素酶活性無顯著變化，見表4。pcDNA-DANCR組HUVEC中miR-423-5p表達顯著低于pcDNA-con組（P<0.05）；si-DANCR組HUVEC中miR-423-5p表達顯著高于si-con組（P<0.05），見表5。

表4 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（±s，n=9）

表4 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P<0.05.

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表5 RT-qPCR檢測miR-423-5p的表達（±s）Tab.5 RT-qPCR detects expressions of miR-423-5p（±s）

表5 RT-qPCR檢測miR-423-5p的表達（±s）Tab.5 RT-qPCR detects expressions of miR-423-5p（±s）

Note：Compared with pcDNA-con，1）P<0.05；compared with si-con，2）P<0.05.

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圖3 miR-423-5p和LncRNA DANCR結合預測示意圖Fig.3 Schematic diagram of miR-423-5p and LncRNA DANCR binding prediction

2.5 過表達miR-423-5p可以逆轉DANCR過表達對ox-LDL誘導的HUVEC增殖和凋亡的影響與ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-con組 比較，ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-423-5p組HUVEC中miR-423-5p表達顯著升高，細胞存活率、CyclinD1蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高（P<0.05）。見表6、圖4。

表6 過表達miR-423-5p可以逆轉DANCR過表達對ox-LDL誘導的HUVEC增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 miR-423-5p overexpression can reverse effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDLinduced HUVEC（±s，n=9）

表6 過表達miR-423-5p可以逆轉DANCR過表達對ox-LDL誘導的HUVEC增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 miR-423-5p overexpression can reverse effect of DANCR overexpression on proliferation and apoptosis of ox-LDLinduced HUVEC（±s，n=9）

Note：Compared with ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-con，1）P<0.05.

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圖4 過表達miR-423-5p可以逆轉DANCR過表達對ox-LDL誘導的HUVEC細胞增殖和凋亡的影響Fig.4 miR-423-5p overexpression can reverse effect of DANCR overexpression on proliferation and apop?tosis of ox-LDL-induced HUVEC cells

2.6 ELISA檢測各組炎癥因子分泌水平與NC組比較，ox-LDL組HUVEC上清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高（P<0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL+pcDNA-DANCR組、ox-LDL+anti-miR-423-5p組HU‐VEC上清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低（P<0.05）；與ox-LDL+pcDNA-DANCR組相比，ox-LDL+pcDNA-DANCR+miR-423-5p組HUVEC上 清 中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高（P<0.05）。見表7。

表7 ELISA檢測各組炎癥因子分泌水平（±s，n=9）Tab.7 ELISA detects secretion levels of inflammatory factors in each group（±s，n=9）

表7 ELISA檢測各組炎癥因子分泌水平（±s，n=9）Tab.7 ELISA detects secretion levels of inflammatory factors in each group（±s，n=9）

Note：Compared with NC，1）P<0.05；compared with ox-LDL，2）P<0.05；compared with ox-LDL+pcDNA-DANCR，3）P<0.05.

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3 討論

AS是冠心病和腦卒中的主要病理基礎，是心血管疾病發生的主要原因。內皮細胞損傷及其功能障礙在AS的發展中起著至關重要的作用，探討與內皮細胞損傷相關的基因，分析其作用機制，有望為AS治療提供新的策略。

LncRNA DANCR在缺氧誘導的大鼠心肌細胞中表達降低，LncRNA DANCR高表達通過上調缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）表達減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷［8］。LncRNA DANCR高表達可增強糖氧剝奪處理的腦微血管內皮細胞的增殖、遷移和血管生成，對改善缺血性腦卒中具有重要意義［9］。本研究結果表明，ox-LDL處理HU‐VEC后，細胞存活率顯著降低，凋亡率顯著升高，Lnc-RNA DANCR表達量顯著降低。IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的分泌是參與AS的發病機制的重要因素［10-11］。本研究顯示，ox-LDL誘導后HUVEC上清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，提示LncRNA DANCR低表達可能與ox-LDL誘導的HUVEC損傷有關。CyclinD1是一種重要的周期蛋白，磷脂酰肌醇激酶抑制劑BYL719通過下調CyclinD1表達可誘導HUVEC阻滯于G1期，抑制細胞增殖［12］。Cas‐pase-3是細胞凋亡發展中最關鍵的執行分子，其活化是檢測細胞凋亡的重要指標［13］。進一步轉染DANCR過表達載體上調LncRNA DANCR表達發現，ox-LDL誘導的HUVEC存活率、CyclinD1升高，凋亡率、Cleaved-caspase-3表達降低，IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，說明過表達LncRNA DANCR能夠改善ox-LDL誘導的HUVEC炎癥反應和凋亡。

miRNA為非編碼RNA家族重要成員，研究顯示，miRNA通過與LncRNA相互作用參與調解氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應等多種細胞過程［14-16］。為探索LncRNA DANCR作用機制，本研究發現miR-423-5p是其潛在靶基因。研究表明缺氧誘導的心肌細胞中miR-423-5p表達增加，miR-423-5p高表達導致線粒體膜電位的丟失、活性氧生成增加，促進心肌細胞凋亡［17］。在急性腎損傷后，miR-423-5p通過誘導內質網絡應激和氧化應激，抑制腎小管上皮細胞的修復［18］。此外，LncRNA RPSAP52通過靶向下調miR-423-5p能夠抑制缺氧誘導的腎近端小管上皮細胞凋亡［19］。本研究顯示，ox-LDL誘導后HU‐VEC中miR-423-5p表達顯著升高，抑制miR-423-5p表達可提高HUVEC存活率，減輕ox-LDL誘導的HUVEC凋亡、炎癥因子分泌，與過表達LncRNA DANCR作用一致。進一步研究證實，LncRNA DANCR對miR-423-5p具有靶向負調控作用，且過表達miR-423-5p能夠逆轉LncRNA DANCR對ox-LDL處理的HUVEC炎癥因子分泌、存活、凋亡以及相關蛋白表達的影響，說明LncRNA DANCR可提高靶向miR-423-5p減輕ox-LDL誘導的HUVEC炎癥反應和凋亡。

綜上所述，ox-LDL引起HUVEC中LncRNA DANCR表達降低，過表達LncRNA DANCR通過靶向下調miR-423-5p可促進HUVEC存活，改善ox-LDL誘導的HUVEC炎癥反應和凋亡，為基于HUVEC損傷的AS治療提供了新的方向。