草地早熟禾NAC基因鑒定及非生物脅迫下表達模式分析

朱瑞婷，牛奎舉，張然，馬暉玲

(甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

生存環境對植物生長具有重要影響[1]，其中，干旱、高鹽、低溫、高溫、重金屬等是抑制植物生長發育的主要非生物脅迫因素。干旱脅迫會限制植物生長，改變植物滲透平衡[2]。重金屬會破壞植物細胞中的蛋白質結構，產生有害物質[3]。鹽脅迫會破壞質膜的完整性從而抑制植物生長[4]。高溫脅迫會影響植物的生理代謝，對植物生長造成一定的損害[5]。在長期演變過程中，植物自身形成了一套復雜的防御系統來抵御不良環境的傷害，在這些防御方法中，轉錄因子家族在植物響應外界環境脅迫的轉錄調控中起到了關鍵作用[6]。

轉錄因子是一類通過與脅迫相關基因的特異順式作用元件相結合從而激活或抑制靶基因轉錄的DNA結合蛋白，參與植物在非生物脅迫下的響應[7]。NAC家族是植物特有的一類轉錄因子，具有不同的生物學功能。NAC家族在N端具有保守的NAC結構域，大約有150個氨基酸，C端為高度變異的轉錄激活區[8]。其功能涉及植物生長發育、激素調控和脅迫響應等重要方面[9]。目前在很多植物中已經鑒定出大量NAC家族成員，如石榴(Punicagranatum)[10]、果梅(Prunusmume)[11]、苦蕎(Tartarybuckwheat)[12]、西瓜(Citrulluslanatus)[13]等。不同物種間家族成員的數量與功能存在重要差異，但大量的NAC轉錄因子在非生物脅迫反應中起到調控作用[14-17]。如玉米(Zeamays)ZmNAC84在煙草中的過表達可增強耐旱性[18]，過表達OsNAC5可以增強水稻(Oryzasativa)的耐鹽性[19]，低溫脅迫下番茄(Solanumlycopersicum)SINAM1的過表達減輕了番茄在遭受低溫脅迫后的氧化損傷[20]。

草地早熟禾(Poapratensis)是禾本科早熟禾屬植物，廣泛分布于北溫帶冷濕潤地區，是一種多年生冷季型禾草，葉形美觀，具根狀莖，是優良的草坪草。草地早熟禾喜冷涼濕潤的氣候，耐寒性較強，但抗旱性較差[21]。隨著全球性氣候、生態和環境問題日益嚴重，尤其是全球變暖的加劇，干旱、高鹽、高溫、重金屬污染已經成為制約農業發展的主要因素[22]，提高草坪草的抗逆性是目前草坪研究中的熱點問題。草坪草抗逆基因的鑒定對了解其響應逆境脅迫的分子機制和抗逆新品種的選育具有重要意義。有關非生物脅迫下草坪草NAC基因表達模式分析的報道較少，草地早熟禾NAC基因尚未被完全鑒定。本課題組前期進行了草地早熟禾抗旱、抗寒、耐鎘轉錄組分析，發現NAC基因家族基因參與草地早熟禾的逆境脅迫響應。本研究以前期組裝的草地早熟禾轉錄組數據庫為基礎，對具有全長cDNA的草地早熟禾NAC基因進行鑒定并分析其不同脅迫下的表達模式，為草地早熟禾NAC基因家族的分子調控機理研究提供理論依據，有助于優良基因資源的挖掘和新品種培育。

1 材料和方法

1.1 供試材料與生長條件

試驗材料為草地早熟禾品種巴潤，由北京克勞沃公司提供。采用砂培法種植，將清洗干凈的沙子等量的裝入直徑為9 cm、高度為17 cm的育苗缽中，種子直接播種后于生長室中培養。培養條件為：白天溫度為25℃，時間為16 h，光照強度為6 000 lx，夜晚溫度為20℃，時間為8 h，濕度為50%。播種20 d后，用Hoagland營養液培育，持續培養4周，在此期間每隔5 d換1次營養液和蒸餾水。

1.2 植物處理

選擇長勢一致的幼苗，對其進行6組處理，每組處理4個重復，第1組為對照：正常營養液栽培；第2組為鹽處理：200 mmol/L NaCl溶液栽培；第3組為干旱處理：15% PEG-6000溶液栽培；第4組為低溫處理：0℃培養；第5組為高溫處理：38℃培養；第6組為重金屬處理：3 mmol/L CdCl2溶液栽培。處理時間6、24、48 h、7 d，每次取樣4次重復，取其葉片，迅速放入液氮中冷凍后保存于-80℃。

1.3 全長草地早熟禾NAC基因的鑒定

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)NAC蛋白序列可根據文獻提供的登錄號在NCBI上搜索獲得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)[23]。在BioEdit軟件中，將本實驗室已有和報道的5個草地早熟禾轉錄組數據庫作為本地數據庫[24-28]，以二穗短柄草NAC蛋白序列作為請求序列，Program選擇：‘tblastn’，Expectation Value選擇E-20，搜索本地草地早熟禾數據庫。將所得到的序列通過NCBI網站中的blastX進行搜索比對，獲得候選序列。

1.4 序列分析及構建系統進化樹

通過ExPASy在線網站上的Prat Param工具對草地早熟禾NAC家族基因的理化性質進行初步預測，包括基因的大小、分子量、等電點、不穩定指數、親水性的平均值和脂肪指數。通過MEME網站(http://meme-suite.org/tools/meme)對草地早熟禾NAC基因的保守基序進行分析。根據在線網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預測草地早熟禾NAC基因的編碼蛋白序列，采用鄰近法在MEGA 7.0軟件上對PpNACs進行聚類分析。

1.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)

RNA提取使用天根公司植物RNA提取試劑盒，RNA反轉錄使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒，第1步去除基因組DNA反應，第2步為反轉錄合成cDNA，稀釋20倍作為模板。使用NCBI在線網站Prime-BLAST( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)進行引物設計(表1)。利用天根熒光定量試劑盒進行qRT-PCR分析，20 μL反應體系如下：模板5 μL，引物2 μL，ddH2O 3 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL。熒光定量PCR的條件為：95℃預變性15 min，40個循環的PCR擴增，包括95℃變性10 s和58℃退火30 s。內參基因為ACT，每個樣品設3次技術重復，基因的相對表達量使用2-ΔΔCT法計算[29]。

表1 定量PCR引物

1.6 數據分析

采用SPSS 23.0軟件進行T檢驗，并用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 草地早熟禾NAC基因家族的生物信息學分析

2.1.1 草地早熟禾NAC轉錄因子的鑒定 根據二穗短柄草的NAC蛋白序列，在BioEdit軟件中搜索本地草地早熟禾數據庫，通過搜索比對得到15個草地早熟禾NAC全長cDNA序列，具有完整的ORF序列，根據草地早熟禾拉丁名將其命名為PpNACs(表2)。結果表明，15個草地早熟禾NAC基因中分子量在61 184.22(PpNAC18)～163 713.04(PpNAC20)，等電點在4.89～5.04，都屬于酸性蛋白；不穩定系數除了PpNAC16外都大于40，屬于不穩定蛋白；親水性系數在0.705～1.022，屬于疏水性蛋白(大于零表示疏水性蛋白，小于零表示親水性蛋白，在±0.5之間為兩性蛋白)。

表2 15個全長草地早熟禾NAC轉錄因子理化性質分析

2.1.2 PpNACs基因的motif分析和聚類分析 采用MEME網站在線預測草地早熟禾NAC基因的保守結構域，可知15個NAC家族基因一共由12種motif組成(圖1)。其中，motif 2和motif 7在所有草地早熟禾NAC基因中都存在。草地早熟禾NAC基因由多種motif組成，除PpNAC16、PpNAC18、PpNAC21和PpNAC23外都具有motif 1-7。Motif 1在80%的PpNACs中存在，Motif 2和motif 6在87%PpNACs中存在。

圖1 草地早熟禾NAC基因的基序結構和聚類分析Fig.1 Motif composition and cluster analysis of NAC genes in Poa pratensis

對15個NAC家族基因進行聚類分析，可分為3大類，第1類包括PpNAC1、PpNAC9、PpNAC10、PpNAC11、PpNAC13、PpNAC24，都含有motif 1-7；第2類包括PpNAC2、PpNAC16、PpNAC18、PpNAC19、PpNAC21、PpNAC23，都含有motif2和motif7；第3類包括PpNAC6、PpNAC17和PpNAC20，都含有motif 1-7、motif 9和motif 11。

2.2 草地早熟禾NAC基因家族表達模式分析

2.2.1 重金屬脅迫下NAC基因的表達PpNAC9和PpNAC16隨著時間的增大，呈現逐漸上升的趨勢，在7 d時達到最大值，分別是對照的6.53倍和8.27倍；PpNAC1、PpNAC2在6 h時表達量顯著增大，隨后呈現下降又上升的趨勢；PpNAC23在48 h時表達量顯著增大，在其他時間段無顯著性變化；PpNAC10和PpNAC18在7 d時表達量達到最大，分別是對照的223.33倍和99.72倍；PpNAC1、PpNAC2、PpNAC10、PpNAC11、PpNAC13、PpNAC16、PpNAC17、PpNAC19、PpNAC24在4個時間段內均有顯著性變化(圖2)。

圖2 重金屬脅迫下NAC基因的表達分析Fig.2 Relative expression level of NAC genes under heavy metal treatment注：豎線表示標準誤，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2.2 鹽脅迫下NAC基因的表達PpNAC9和PpNAC13在四個時間段內都有顯著性變化，PpNAC9、PpNAC10、PpNAC11、PpNAC16、PpNAC18、PpNAC19、PpNAC20、PpNAC23在7 d時表達量達到最大值，PpNAC10在7 d時表達量是對照的50.88倍，PpNAC24在6 h時表達量顯著增大，在48 h時表達量達到最大，是對照的36.33倍。PpNAC1、PpNAC13、PpNAC17在6 h是表達量顯著性增大，隨后呈現先下降后上升的趨勢，響應短期脅迫和長期脅迫(圖3)。

圖3 鹽脅迫下NAC基因的表達分析Fig.3 Relative expression level of NAC genes under salt treatment

2.2.3 干旱脅迫下NAC基因的表達PpNAC9、PpNAC11、PpNAC17在干旱脅迫48 h內變化不大，在7 d時表達量有明顯的增大，響應長期干旱脅迫。PpNAC1和PpNAC13在0～48 h內呈現先上升后下降趨勢，在48 h～7 d呈現上升趨勢且在7 d時表達量達到最大，分別是對照的94.08倍和80.30倍。在干旱脅迫下PpNAC2和PpNAC24在6 h時表達量顯著增大，達到最大值，而其他基因在7 d時表達量達到最大值(圖4)。

圖4 干旱脅迫下NAC基因的表達分析Fig.4 Relative expression level of NAC genes under drought treatment

2.2.4 低溫脅迫下NAC基因的表達 在低溫脅迫下，PpNAC2和PpNAC13在6 h表達量顯著增大，24 h持續增大達到最大值，48 h呈現下降趨勢，表達水平受到抑制，7 d又出現上升趨勢。PpNAC1和PpNAC10的表達量呈現先上升后下降的趨勢，在24 h達到峰值，分別是對照的66.38倍、98.46倍。PpNAC17的表達量隨時間的增大表現出上升趨勢。PpNAC21的表達量與對照相比在短期處理時表現出顯著增大，在長期處理時表現出顯著減小。低溫脅迫下PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC13、PpNAC16、PpNAC17的表達量均高于對照(圖5)。

圖5 低溫脅迫下NAC基因的表達分析Fig.5 Relative expression level of NAC genes under low temperature treatment

2.2.5 高溫脅迫下NAC基因的表達 研究表明，該家族大部分成員在高溫7 d時的表達水平較高。在高溫脅迫下，PpNAC16的表達量均具有顯著性變化，表達水平上調。隨著高溫處理時間的增大，PpNAC17、PpNAC19和PpNAC20的表達持續上調，在7 d時處于較高的表達水平，分別是對照的5.85倍、5.35倍和11.63倍(圖6)。

圖6 高溫脅迫下NAC基因的表達分析Fig.6 Relative expression level ofNAC genes under high temperature treatment

3 討論

在其他高等植物如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻中，NAC轉錄因子的功能已被闡明，具有相似結構域的蛋白質具有相同或相似的生物學功能[30]，已有文獻報道，構建進化樹預測其功能的方法可應用于其他物種[21]，因此，通過對草地早熟禾和二穗短柄草NAC基因家族的系統進化樹分析，有助于預測同一亞族的PpNACs基因的功能。已知的NAC基因家族成員參與植物的生長發育和不同脅迫反應，揭示了NAC基因的序列多樣化導致功能的多樣化[31]，為草地早熟禾NAC基因家族的鑒定提供了堅實的基礎。草地早熟禾可用于草坪草的種植和提高城市綠化覆蓋率，但耐寒性強，抗旱性較差。NAC基因家族具有高度保守的結構域，對植物的非生物脅迫應答過程具有重要的作用。本試驗從草地早熟禾轉錄組數據庫中鑒定出15個全長cDNA 序列的NAC基因。PpNACs家族成員的等位點在4.89～5.04，與李偉[32]克隆所得PpNACs基因的等位點為5.30相一致，都屬于酸性蛋白；與二穗短柄草和水稻NAC基因家族成員數目相差較大，可能是在進化過程中出現了丟失，也可能是由于轉錄組數據庫有限而導致NAC基因家族成員的不完整性。根據NAC基因的保守結構域分析發現，PpNACs家族基因在N端含有基本的NAC結構域，NAC結構包括N端的DNA結合區和C端的轉錄激活區，N端大約有150個氨基酸殘基，分為A～E 5個亞結構域， A、C、D結構域為主要的親水區，E結構域為主要的疏水區，在PpNACs轉錄因子家族成員中都含有E結構域，都屬于疏水性蛋白。

在重金屬脅迫下，PpNACs基因隨著脅迫時間的延長呈現不同的趨勢，而在此脅迫過程中PpNAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24為高表達。研究表明，水稻中NAC基因參與銅脅迫過程[33]，在西瓜中NAC基因家族在緩解鎘脅迫中可能具有重要作用[34]，關于NAC基因家族在重金屬脅迫中的研究很少，初步推測PpNAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24在鎘脅迫過程中起到重要作用。PpNACs基因在鹽脅迫下大部分呈現上升下降再上升的趨勢，而且在第7 d時都表現為上調，PpNAC10和PpNAC24在鹽脅迫過程中表現出高表達量，出現的峰值時間不同，分別在7 d和48 h。研究表明，過表達ONAC045可提高水稻的耐鹽性[35]，在擬南芥中過表達CiNAC3表現出更強的耐鹽性[36]。因此，PpNAC10和PpNAC24基因可作為研究草地早熟禾耐鹽性的候選基因。在干旱脅迫下，所有PpNACs基因在不同的時間響應程度不同，表達量均有不同程度的增加，在第7 d時表達量具有顯著差異性(除PpNAC24外)，均高于對照。PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC13基因在7 d表現出高表達量，而在擬南芥中超量表達NAC基因可提高其抗旱性[37]。在干旱脅迫下水稻OsNAC095基因的表達量增加，通過減少體內水分的喪失提高水稻的抗旱性[38]。同樣在本試驗干旱脅迫下所有基因的表達量都有所增加，因此推測這些基因參與草地早熟禾對干旱脅迫的調控，PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC13可能在抗旱性方面起到重要作用。

在低溫脅迫下，PpNACs基因具有不同的表達趨勢，有的基因在脅迫過程中表現為全部上調，如PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC16和PpNAC17；有的基因在脅迫過程中的表達趨勢為先上升后下降再上升，如PpNAC2和PpNAC13；有的基因則表現為先上升后下降再上升又下降的趨勢，如PpNAC6、PpNAC9、PpNAC16、PpNAC21和PpNAC24。在高溫脅迫下，除PpNAC20外的其他基因表達量的變化在10倍以內。PpNACs基因表達量的變化趨勢具有多樣性，如PpNAC1、PpNAC16和PpNAC20在脅迫過程中都表現為上調；PpNAC16、PpNAC23和PpNAC24在脅迫過程中為上升下降上升下降趨勢。由此發現在高低溫脅迫下PpNAC1和PpNAC16都表現為上調，PpNAC24都呈現“M”趨勢，它們在溫度脅迫下具有相同的變化趨勢，可能是受到相同的分子調控，參與相同的調控路徑。在茶樹(Camelliasinensis)中CsNAC1和CsNAC2響應溫度脅迫并有復雜的調控機制[39]。本試驗表明PpNACs基因響應高溫和低溫脅迫，不同基因響應高低溫脅迫程度不同，體現了PpNACs基因在溫度脅迫下具有復雜的調控性。研究發現，低溫脅迫下番茄中SlNAM1基因的過表達會提高滲透物的含量，降低超氧陰離子的含量，提高植株的抗寒性[20]。PpNAC1和PpNAC10在24 h表現為高表達量，PpNAC18在48 h表現為高表達量，它們可以作為草地早熟禾對低溫脅迫下調控的候選基因。研究發現在番茄中抑制SlNAC1的表達影響熱激蛋白的積累，轉基因植株的抗性降低，SlNAC1在番茄耐高溫中起到正調控作用[40]，本研究中PpNAC20在高溫脅迫下為高表達，它可能在耐高溫過程中起到重要作用。

在本試驗中同時分析了PpNACs基因在重金屬、高鹽、干旱、高溫和低溫脅迫下的表達情況，15個PpNACs基因具有不同的表達模式，這些基因參與多種信號傳導途徑，為確定基因功能提供了重要信息[41-42]。試驗發現PpNAC10在重金屬、高鹽、干旱和低溫脅迫下為高表達，PpNAC18在重金屬、干旱和低溫脅迫下為高表達，PpNAC10和PpNAC18在多種非生物脅迫下表現突出，因此可將PpNAC10和PpNAC18作為候選基因進行功能驗證。

4 結論

根據二穗短柄草的蛋白序列和草地早熟禾轉錄組數據，通過生物信息學分析得到15個PpNACs基因全長cDNA序列，具有完整的開放閱讀框。15個PpNACs轉錄因子都是酸性蛋白，除了PpNAC16，其他都屬于不穩定蛋白，疏水性蛋白。PpNACs成員通過聚類分析可分為3類，Motif分析發現大部分PpNACs基因家族成員具有motif 1、2、3、4、5、6、7，具有相似的結構。通過qRT-PCR分析草地早熟禾在不同非生物脅迫下的表達水平發現，15個PpNACs基因均能響應不同的非生物脅迫，具有不同的表達模式，與重金屬脅迫相關的基因有PpNAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24；與耐鹽性相關的基因有PpNAC10和PpNAC24；與抗旱性相關的基因有PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10和PpNAC13；與耐寒性相關的基因有PpNAC1、PpNAC10和PpNAC18；與耐高溫相關的基因有PpNAC20，綜上發現PpNAC10和PpNAC18在多種抗逆過程中起到重要作用，可作為后續功能驗證試驗的候選基因。