土壤中可降解塑料微生物的分離和初步鑒定*

蔣欣怡，王書卿，楊怡萱，朱振洪

（浙江中醫藥大學 生命科學學院，浙江 杭州 310053）

塑料制品具有強度較高、質量較輕、抗腐蝕、價格較便宜等優點，在人們生產生活中得到了廣泛應用[1]。塑料的應用在給人們帶來極大便利的同時也帶來了很大程度上的負面影響。當今，大部分廢棄塑料制品只有通過焚燒、使用化學試劑等方法才能快速降解，在自然環境中通過光、生物降解[2]的速度非常緩慢，大概需要幾百年的時間才可能降解到完全消失[3]，研究發現有一些菌種可以以塑料為食并在其上生長，菌種產生的酶將其轉化為自己生長所需的物質[4-5]且不會破壞[6-7]環境[8]。所以當前利用生物技術處理廢棄塑料[9]已經成為了非常值得研究的內容。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、可溶性淀粉、聚乙烯醇（PVA）、聚氯乙烯（PVC）。

1.1.2 主要儀器

PCR擴增儀、臺式冷凍離心機、立式壓力蒸汽滅菌器、瓊脂糖DNA凝膠電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 土壤菌種的采樣

在杭州市生活垃圾填埋場周邊的土壤中采樣，挖取地表下約15cm的土壤用塑料袋裝好，取回保存備用。

1.2.2 土壤微生物的分離

（1）通過稀釋涂布的方法將菌種進行濃度梯度分離，劃分成細菌、真菌。（2）觀察并標記不同形態、類型的菌落，進行挑菌分離培養。（3）通過分析菌種的長勢、形態，觀察其中是否含有其他菌種，并再次進行分離，以確保菌種分離的完整性。

1.2.3 菌種的選擇性培養

將固定培養基培養的純化菌種培養在以PVA、PVC為碳源的培養基上，觀察是否生長（細菌大概1-2天的生長周期，放線菌和真菌大概3-5天生長周期）。

1.2.4 菌種的液體培養以及對塑料薄模和塑料包裝袋的分解速率及測定

（1）配制液體培養基（真菌為改良的馬丁氏培養基，放線菌為高氏1號培養基，細菌為LB培養基）。（2）將紫外線處理后的塑料薄模長寬約5cm×5cm的小塊片段放入液體培養基中，并將相關的菌種接種到其液體培養基內培養，大約2-3天后拿出液體培養基中的塑料薄模小塊片段，通過對照實驗，觀察菌種對其的影響。（3）用100mL錐形瓶培養菌種，并將紫外線處理后的塑料薄模小塊片段放入液體培養基中，觀察分解效率和強度。（4）通過對照實驗，改變碳源（氯化鈉1g，胰蛋白胨1g，酵母粉0.5g，蒸餾水100ml）的用量，促進菌種基因的表達，減少遏制基因的作用，對比碳源的用量觀察分解速率找出最適合表達基因、酶活性的用量。（5）加入表面活性劑，改變培養液的用量，促進酶的活性，促使微生物能夠發酵產生更多的酶，促進對塑料的降解。

1.2.5 菌種的凍存與復蘇

菌種凍存一般加20%甘油，-80℃保存。復蘇時將甘油菌保存的菌種冰上解凍后，劃線接種在固體培養基上，再將固體培養基的單菌落接種到液體培養基中。

1.2.6 基因組的提取與檢測

（1）運用試劑盒提取降解塑料的基因組，將提取的基因組溶解于30μL TE緩沖液中。（2）將0.5μL 10×Loadding Buffer與4.5μL DNA溶液混合，加入凝膠中，用凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2.7 PCR擴增與電泳檢測

（1）設置PCR程序和體系PCR引物：ddH2O 18.26μL；PCR Buffer 2.5μL；dNTP 2μL；上游引物：0.25μL；下游引物：0.25μL；模板（基因組）1μL。PCR程序：a.94℃預變性；b.94℃變性30S；c.57℃復性30S；d.72℃延伸30S，返回第2步，循環3次；e.94℃變性30S；f.54℃復性30S，72℃延伸30S，返回第5步，循環27次；g.72℃，10min。（2）將0.5μL10×Loadding Buffer與4.5μL PCR產物混合，加入凝膠中，用凝膠成像儀觀察條帶質量。1.2.8測序（測定核苷酸序列）

將PCR產物和上下游引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）送到上海桑尼生物技術公司測序。

1.2.9 將序列網上比對鑒定菌種

通過NCBI序列比對查找同源性較高的片段并添加到MAGA5.0軟件中進行比對運算，并制作進化樹并分析其同源性。

2 結果

2.1 通過稀釋涂布的方式進行初步的種屬菌種分離

通過稀釋涂布法，將培養液稀釋到10-6所形成的濃度為真菌分離最適宜的挑菌濃度，將培養液稀釋到10-7所形成的濃度為細菌分離最適宜的挑菌濃度，并且培養的菌種形成肉眼可觀察到的單菌落。菌落大小、形態各異，放線菌顏色大部分較為鮮艷并且有光澤、略帶有土腥味，細菌顏色大部分偏黃色略帶臭味，真菌偏乳黃色，乳白色居多略帶酒香味和霉味。

2.2 接種在固定菌種的培養基中進行再次分離

初步分離得到單菌落培養，細菌分離出4種不同形態、顏色和大小的菌株、真菌分離出3種不同形態、顏色和大小的菌株，并且菌落特征與初步分離得到的菌落特征基本一致。

2.3 將純化的菌種培養在以PVA（聚乙烯醇）為唯一碳源的培養基上

當2.2中初步分離的菌株在含PVA的選擇性培養基上生長時，發現真菌1、2、3號可在PVA選擇培養基上生長，并且長勢良好，無雜菌污染，形成單菌落，菌落形態、顏色和大小也與固定培養基形態一致，如圖1（A）所示。而分離的細菌有兩株可在PVA選擇培養基上生長，如圖1（B）所示。

圖1 微生物在PVA選擇培養基上生長

2.4 將純化的菌種培養在以PVC（聚氯乙烯）為唯一碳源的培養基上

由圖2可知，所分離的真菌1、2、3號也可在PVC選擇培養基上生長，并且長勢良好，無雜菌污染，形成肉眼可觀察到的單菌落形態。所分離的細菌均不可在PVC選擇培養基上生長。

圖2 真菌在PVC選擇培養基上生長

2.5 菌種的液體培養以及對塑料薄膜和塑料包裝袋的分解速率及測定

從圖3中可以看出，與對照組（長5cm，寬5cm）相比，真菌1、2、3號具有一定的分解效果，真菌1號作用的塑料薄膜邊緣皺略縮成團狀（長4.5cm，寬4.5cm）并且中間有小孔，用手觸摸質感不及對照組光滑；真菌2號作用的塑料薄膜（長3cm，寬3cm）邊緣有部分皺縮用手觸摸質感不及對照組光滑；真菌3號作用的塑料薄膜中間皺縮（長5cm，寬2cm）用手觸摸質感不及對照組光滑。

圖3 三株真菌對塑料薄膜作用效果圖

2.6 基因組的提取與PCR的擴增

通過提取基因組作為模板，并利用PCR技術，以ITS1和ITS4作為上下游引物，擴增獲得PCR產物。通過凝膠電泳成像儀拍照顯示，從真菌1、2、3號中擴增出的PCR產物大小為400bp左右（如圖4所示）。產物送至上海桑尼生物技術公司進行測序。

2.7 序列的分析

由圖5可知，真菌1號與白地霉WLL1株擁有最高的同源性，同屬于地霉屬，生物體間的遺傳差異數值大約為0.2個單位；真菌2號與白念珠菌培養CBS：11616和真菌CMH122擁有最高的同源性，同屬于地霉屬，生物體間的遺傳差異數值大約為0.5個單位；真菌3號與地霉分離株M14擁有最高的同源性，也同屬于地霉屬，生物體間的遺傳差異的數值大約為1個單位。

圖5 真菌1、2、3號進化樹分析圖

3 討論

近年來，生物降解塑料得到重視。對于中國這樣一個塑料制品生產和消費大國，生物降解塑料的研發、生產與應用對塑料產業的可持續發展具有更加重要的意義，也符合中國的國情、可持續發展的戰略。此實驗可以實現對綠色資源的循環利用。同時，生物降解的方法也逐漸受到人們的重視，對能源的再利用也有很深遠的影響。根據這種現狀我們的實驗項目尋找具有塑料分解能力的微生物[10]，并在實驗后期嘗試找出其中分解能力較強的菌種，提取其關鍵酶[11]，高表達菌株篩選并進行基因改造，大大提高了分解塑料的能力，運用到后期生產的話，可為解決塑料污染問題提供方向。

目前，利用微生物降解塑料已經成為了研究熱點。宋力等[12]研究發現環境因素和微生物數量均會影響生物塑料在水生系統中的降解效果。環境因素主要是通過相應微生物產生的生物塑料降解酶影響生物塑料的降解性;海水中附著的微生物數量則通過改變塑料的形狀影響生物塑料的降解性。2016年，可消化PET塑料的細菌Ideonella sakaiensis 201-F6品種被發現，相比其他的細菌酶，這種酶能更快更有效地對塑料進行分解，具有用于生物循環的潛能[13]。與此同時，某團隊研究出了一種混菌體系可以高效降解塑料。他們根據細菌一種十分巧妙的代謝方式，來保持混菌系統的穩定，并且這些菌可以相互協作，更高效地完成對塑料的降解[14]。

本實驗利用基因組提取技術、PCR技術對微生物進行分子生物學基礎操作，通過擴增片段完成測序及運用MAGA生物軟件對序列的同源性進行鑒定，推斷出其種屬以及同源性[15]。根據目前研究結果顯示能夠分解塑料的微生物分布特點以及作用強度、作用方式及微生物的類別，后續需繼續大量發酵提取蛋白并對其進行純化，通過核磁共振儀、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、酵母雙雜交等技術分析蛋白的結構和功能或者進行微生物分解塑料功能片段的擴增，以及過表達、基因敲除等方式對基因進行功能分析，以便于更好地解決生活中的白色污染問題[16]，從而有利于促進我們處理塑料制品采用便捷的方式。

4 結束語

本文運用微生物分離、發酵、分子鑒定的技術，前期通過取土樣分離微生物，隨后在選擇培養基（PVA、PVC）上培養觀察生長狀況，再運用微生物液體培養基發酵技術以及觀測微生物對塑料薄模的分解能狀況，進一步判斷微生物的分解能力，最后利用分子鑒定技術對所分離的微生物進行種屬鑒定。下一步可通過微生物培養條件的優化，以及相關酶基因的研究，更好地發揮微生物對廢棄塑料的降解。