高通量測序分析南美洲圭亞那輸變電周圍金屬銹蝕材料中細菌多樣性的研究

李 苗

（中國機械進出口（集團）有限公司，北京 100037）

0 引言

2009年10月28日，中機公司與圭亞那電力照明公司成功簽訂了圭亞那輸變電項目的EPC總承包合同，該項目內容主要包括：架設110公里輸電線路、新建7個變電站、擴建和改造原有3個變電站、鋪設2.1公里海纜、架設95公里69千伏高壓輸電線路和154公里的ADSS通訊光纜，項目總工期為912天。

南美洲圭亞那國地處熱濕的赤道地區，常年濕度高、溫度變化小，平均氣溫在24～32°C之間，全年有兩個雨季，常年濕熱多雨，年均降水量超過1600～3000mm，相對濕度為70%～100%，高溫多濕的環境條件有利于輸變電金屬設備材料表面的微生物生長，容易促進金屬銹蝕。此外，由于變電站和輸電線路的所使用的設備和材料，常常會安裝在戶外，會經受長年累月的自然環境侵蝕，包括風吹、日曬和雨淋，這些都促進了設備和材料的表面微生物的生長，進而導致金屬銹蝕。

通常情況下，微生物腐蝕（Microbiologically Influenced Corrosion，MIC）導致的金屬腐蝕，是因腐蝕微生物在金屬表面繁衍和新陳代謝，進而改變了金屬理化性質和穩定性，從而引起金屬電化學腐蝕[1]。微生物腐蝕對工農業眾多部門造成了巨大影響和經濟損失，全球因微生物腐蝕造成的經濟損失約占總腐蝕的20%[2]。因此，微生物腐蝕的有效防治迫在眉睫，而對金屬銹蝕相關微生物的研究也具有非常重要的意義。

與金屬銹蝕相關的微生物在生理上是多樣的，其中細菌廣泛參與鋼、鐵、銅、鋁及其合金腐蝕過程，如硫酸鹽還原菌、硫氧化菌、鐵氧化及還原菌、錳氧化菌和有機酸分泌菌[2,3]。目前，雖然國內外對金屬銹蝕材料中細菌物種多樣性及其作用已有相關報道，但研究多基于傳統的分離培養，并根據其形態、生理、生化等實驗來確定細菌種類，例如，對銹蝕樣品中可培養細菌進行分離培養以鑒定其種類[4]，其局限性在于培養條件的限制導致許多細菌種類無法培養，也有采用克隆文庫的方法進行金屬腐蝕材料中細菌多樣性研究[5,6]，但僅僅分析序列的通量低，從而無法完全反映樣本中的細菌群落情況。

目前，基于DNA測序的高通量技術廣泛地運用到環境樣本中微生物多樣性及其群落結構研究[7,8]，其可以深度揭示環境中豐富的微生物多樣性，包括大量可培養及未培養的微生物類群。目前為止，利用高通量測序來分析金屬銹蝕材料中細菌物種多樣性及其群落組成的研究報道較少。

圭亞那輸變電項目已經順利建成和移交，而設備在服役過程中的銹蝕與防護問題是今后關注的重點。本研究采用高通量測序技術對圭亞那輸變電周圍區域金屬銹蝕樣品中細菌物種多樣性及其群落組成進行研究，揭示了該區域具腐蝕作用的微生物種類，這將為設備供貨商的研發人員提供在設備防銹蝕策略方面的理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究地點和樣品采集

采樣地點位于南美洲圭亞那輸變電項目工程沿線周圍區域（如圖1所示），6份金屬銹蝕樣品均使用表面消毒（75%乙醇）的采樣鏟采集，將采集的金屬銹蝕樣品直接放入TWIRL’EM無菌采樣袋（Labplas Inc., Sainte-Julie, QC, Canada）。采樣時間為2015年4月，總共采集6個金屬銹蝕樣品（如表1所示）。在圭亞那期間，采集后的銹蝕樣品置于-20°C冰箱中，直至空運帶回國。

表1 圭亞那輸變電周圍區域金屬銹蝕樣品的數據信息

圖1 圭亞那輸變電周圍區域金屬銹蝕樣品采集地點

1.2 微生物DNA提取、PCR擴增及測序

每個銹蝕樣品約0.25g通過PowerSoil DNA提取試劑盒（MO BIO Laboratories，San Diego，CA，USA）進行微生物總DNA的提取。對DNA樣品中16S rRNA 基因的V3～V4區進行擴增，引物為338F（5'-條碼-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R （5'-條碼-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3'）[9]。PCR反應體系（50μL）：5×PCR buffer（with Mg2+）4μL；2.5mmol/L dNTP 2μL；5μmol/L P1 （338F）0.8μL；5μmol/L P2（806R）0.8μL；5U/μL Taq 酶0.4μL；DNA模板2μL；ddH2O10μL。PCR反應條件：95°C 3min；95°C 30s，55°C 30s，72°C 45s，30個循環；72°C 1min。PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后回收產物條帶，Qubit 測定濃度并連接接頭完成文庫構建。其中，PCR實驗及其定量、純化、文庫構建與高通量測序，均由華大基因有限公司完成，測序使用Illumina Miseq PE300測序平臺，產生300 bp配對雙端序列。原始序列數據存入NCBI Sequence Read Archive數據庫（登錄號：PRJNA347281）。

1.3 序列處理及數據分析

配對末端讀取原始的DNA片段使用Flash軟件[10]合并配對序列，配對序列根據分配給每個樣本的獨特條碼來識別，合并時配對序列需要具有部分重疊區域。原始測序數據質量使用QIIME 1.8.0軟件處理[11]（Caporaso et al.，2010），不能組裝的序列被丟棄。操作分類單元（OTU）使用UPARSE軟件按照97%序列相似性進行聚類[12]；使用UCHIME進行嵌合序列的識別和刪除[13]。單克隆序列被刪除。16S rRNA基因序列的分類是通過RDP[14]對Silva rRNA基因數據庫（ http://www.arb-silva.de/）進行比對確定（80%的置信度閾值）。利用MicrobiomeAnalyst（Marker Data profiling，MDP，https://www.microbioeanalyst.ca/）在線分析平臺[15]分析細菌群落的物種豐富度（Chao1指數）、多樣性（香濃指數，H）、在門、綱、目、屬水平上的群落組成、聚類及熱力圖分析。

2 結果

2.1 細菌群落物種豐富度及多樣性

對6份銹蝕樣品進行高通量測序分析，總共發現139626個序列，可劃分為522個可操作分類單元。每個銹蝕樣品中OTU數量在91～303之間（如表1所示）。測序覆蓋率為99.83%～99.91%（如圖2所示），表明數據有效可靠。利用Chao1指數和香濃指數比較不同樣品中細菌群落的豐富度和多樣性（如圖3所示），結果顯示6份不同銹蝕樣品中細菌群落在物種豐富度及多樣性指數方面存在一定差異，其中樣品G2細菌群落的物種豐富度及多樣性指數最低，而樣品G6細菌群落的物種豐富度及多樣性最高。

圖2 6份金屬銹蝕樣品中細菌群落的稀釋度曲線

圖3 6份金屬銹蝕樣品中細菌群落豐富度及多樣性

2.2 細菌群落組成

將高通量測序結果進行分析，6份銹蝕樣品中總共獲得分類學地位明確的細菌有13門、24綱、64目、166屬，此外，還存在部分未指定分類的細菌種類。總體而言，優勢門為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、奇異球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chlor of lexi）。同時不同銹蝕樣品在優勢門也存在一定差異，例如放線菌門（Actinobacteria）在樣品G2和G4中最為優勢，而變形菌門（Proteobacteria） 在樣品G1和G6中最為優勢，擬桿菌門（Bacteroidetes）在樣品G3中最為優勢，綠彎菌門（Chloroflexi）在樣品G5中最為豐富。

6份銹蝕樣品總體統計，優勢綱包括放線菌綱（Actinobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、噬纖維菌綱（Cytophagia）、酸桿菌綱（Acidobacteria）、β-變形菌綱（ Betaproteobacteria）、異常球菌綱（Deinococci）；優勢目包括噬纖維菌目（Cytophagales）、紅色桿菌目（Rubrobacterales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、異常球菌目（Deinococcales）等；優勢屬包括 囊胚菌屬（Blastocatella）、紅色桿菌屬（Rubrobacter）、螺狀菌屬（ Spirosoma）、甲基桿菌屬（Methylobacterium） 、放線孢菌屬（Actinomycetospora）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等（如圖4所示）。

圖4 6份金屬銹蝕樣品中細菌門、綱、目、屬水平的組成柱狀圖

此外，根據不同細菌目在6份銹蝕樣品中的豐度進行聚類分析，從而反映6份銹蝕樣品間在細菌群落相似性、差異性及聚類關系。熱圖（如圖5所示）結果顯示，不同的銹蝕樣品在目水平上存在差異，其中樣品G1，G5和G6聚在一起，樣品G2、G3和G4聚在一起。

圖5 6份金屬銹蝕樣品間微生物群落結構在目水平的熱圖分析

3 討論

微生物腐蝕依賴于組成生物膜的微生物種類及其生物膜生長的因素[16]。目前為止，人們還未能完全了解微生物參與金屬腐蝕過程的機理，其重要原因在于，人們對組成生物膜的微生物仍然知之甚少，本研究采用Illumina高通量測序方法對圭亞那輸變電周圍區域金屬銹層中細菌群落進行分析，有利于了解該區域金屬銹蝕過程中細菌群落組成情況。

本研究發現，圭亞那6份金屬銹蝕樣品中，優勢門為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、奇異球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi），其中變形菌門中優勢菌綱α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）。上述研究與前期他人研究有所不同，例如，欒鑫等[5]通過分子克隆測序，研究海水環境中Q235碳鋼銹層中微生物群落的多樣性，發現13個已知的菌門，包括變形菌門；擬桿菌門；硅藻門；酸桿菌門；浮霉菌門；硝化螺旋菌門；厚壁菌門；綠彎菌門；疣微菌門；綠菌門；放線菌門；紅藻門以及螺旋體門。內外銹層的優勢菌均為變形菌門。

根據種類及功能的不同，腐蝕微生物可以分為硫酸鹽還原菌、硫氧化菌、產酸菌、鐵氧化細菌、鐵還原細菌、硝酸鹽還原菌以及產粘液細菌等[2,3]。但本研究中，高通量測序并未發現常見的硫酸鹽還原菌（例如，Desulfovibrio）、硫氧化菌（例如，Thiobacillus）、產酸菌（例如，Acetobacter）、鐵氧化細菌（例如，Aciditiobacillus）、鐵還原細菌（例如，Geobacter）、硝酸鹽還原菌（例如，Klebsiellamobilis），僅僅發現具有產粘液細菌，例如芽孢桿菌屬（Bacillus）及假單孢菌屬（Pseudononas），它們在金屬表面能產生大量胞外多聚物，這在微生物腐蝕中起著重要作用，是形成的生物膜的基質結構，能使周圍環境在有氧與無氧之間轉化，形成適宜其他腐蝕相關微生物生長的微環境[17]。本研究揭示了圭亞那輸變電周圍區域金屬銹層中細菌群落多樣性，結果表明其細菌群落豐富多樣，但由于許多細菌種屬金屬銹蝕作用尚未明確，所以在本研究中高通量測序發現的細菌種屬還需后續深入功能研究。

目前，對于微生物腐蝕的防治只能延緩腐蝕，其中，實時監測是防治金屬微生物腐蝕的重要措施，對腐蝕過程中微生物群落多樣性、群落組成及生物膜的厚度等進行監測，有助于我們采取控制措施，高通量測序技術的優勢可以用于早期監控，通過早期監測來采取控制措施從而減緩銹蝕，避免事故發生。

如果能阻止微生物接觸到金屬，或者微生物在金屬表層是處于非活性狀態，或者使金屬表面維持電化學穩定，那么腐蝕相關微生物的活動是不會影響金屬銹蝕。基于上述原理，微生物防腐措施可分為物理方法（紫外線、超聲波、電離輻射、機械清除法）、化學方法（亞硝酸鹽和硝酸鹽等殺菌劑或抑菌劑）、電化學保護（陰極保護電位）、表面改性法（表面添加防護涂層，包括鍍鉻、鍍鋅、油漆、塑料、有機涂層等）[18-20]。考慮到圭亞那輸變電工程后續維修成本，建議對輸變電設備進行防護涂層處理，同時利用高通量測序技術對金屬表層微生物群落進行長期監測，對發現的早期金屬銹蝕進行有效防護處理，如采用物理或化學方法進行除菌或抑菌處理。比如，對剛剛出現起泡現象的設備金屬外殼進行去銹、打磨、刷涂冷鍍鋅油漆等。另外，建議相關研發部門在設備表面的涂層中添加某些可以抑制或者殺滅該地區相關微生物的某些藥品，以便在更大程度上減少金屬銹蝕現象。