5種生物農(nóng)藥對(duì)茶輪斑病病原的室內(nèi)毒力強(qiáng)度

饒家瑞， 張 欣， 余用秀

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所， 貴州 貴陽 550006)

茶輪斑病是茶樹最嚴(yán)重的病害之一[1]，其主要危害成葉和老葉。目前，茶輪斑病的田間防治仍然以化學(xué)農(nóng)藥為主，但其農(nóng)藥殘留造成的毒素積累和代謝慢等問題已成為制約茶產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展的關(guān)鍵。近年來，生物農(nóng)藥因其可降解和低毒的特點(diǎn)，已成為茶園田間綠色防控茶輪斑病的新選擇[2]。有研究表明，0.5%香菇多糖對(duì)茶輪斑病菌具有較好的抑制活性，其EC50為2.68 μg/mL[3]；寧南霉素對(duì)茶假擬盤多毛孢菌菌株的EC50為75.92 U/μL[4]；諾沃霉素A在離體條件下對(duì)擬盤多毛孢(Pestalotiopsistheae)的EC50為2.11 μg/mL，在75 μg/mL和150 μg/mL濃度下對(duì)感染茶輪斑病離體葉片的防治效果分別為68.29%和100%[2]；申嗪霉素對(duì)茶輪斑病的EC50為11.23 μg/mL[5]；6%春雷霉素、枯草芽孢桿菌(100億芽孢/g)和戊唑醇430 g/L對(duì)茶輪斑病菌絲的抑制率分別為43.88%、14.29%和44.61%，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率分別為1.38%、46.17%和100%[6]。引起茶輪斑病的菌屬較多，茶擬盤多毛孢(P.theae)、山茶擬盤多毛孢(P.camelliae)等16種菌屬均可引起茶輪斑病[7-8]，用藥難度較大，防控也因地區(qū)不同、病菌種類差異等問題一直困擾著精準(zhǔn)用藥。因此，為精準(zhǔn)防控貴州地區(qū)發(fā)生的茶輪斑病，用5種生物農(nóng)藥對(duì)貴州茶園采樣鑒定后的病原菌進(jìn)行抑菌活性篩選，以期為貴州茶園茶輪斑病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病原菌 茶輪斑病病原菌由張欣等[9]于2020年7月從貴州省銅仁市石阡縣采集，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和毒性回接實(shí)驗(yàn)等鑒定該病菌為茶輪斑病病原(Pestalotiopsistrachicarpicola)，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供。

1.1.2 藥劑 寡糖-乙蒜素、嘧啶核苷類抗菌素等5種生物農(nóng)藥的名稱、成分含量、劑型及生產(chǎn)廠家見表1。無水乙醇，購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；吐溫80，購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；土豆培養(yǎng)基(PDA)，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均購于上海安耐吉化學(xué)試劑有限公司。藥品稱量，均在Sarfori-us型電子天平(精度:0.001 g)上完成。

表1 5種生物農(nóng)藥的名稱、成分含量、劑型及生產(chǎn)廠家

1.1.3 儀器 超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)；BSA224S-CW電子天平；BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜；Mill-Q型超純水儀；20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液槍等儀器。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理，根據(jù)生物農(nóng)藥的相應(yīng)編號(hào)分設(shè)為處理1～處理5，處理6為對(duì)照藥劑春雷霉素(有效成分2%，水劑/低毒，乳山韓威生物科技有限公司，CK1)，處理7為空白對(duì)照等量吐溫80滅菌水(CK2)。每處理3次重復(fù)，隨機(jī)排列。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 5種生物農(nóng)藥抗茶輪斑病的生物活性初篩

1) PDA培養(yǎng)基的配制。稱量洗凈去皮的土豆400 g放于鍋中，加入2.5 L清水，煮開10 min?；?，冷卻10 min，然后用網(wǎng)布過濾掉土豆殘?jiān)?，將土豆汁液與40 g瓊脂、40 g葡萄糖、6 g磷酸二氫鉀、3 g硫酸鎂和20 mg維生素 B1混合均勻，最后以每瓶45 mL倒入100 mL的錐形瓶中封口，在121℃條件下高壓滅菌 20 min，冷卻備用。

2) 藥液配制。在200 mL滅菌水中加入200 μL吐溫80，攪拌均勻。在10 mL離心管中分別加入吐溫80滅菌水1 mL，將5種生物農(nóng)藥分別稱取5 mg分別溶解到離心管中，待其溶解均勻后再加入滅菌水4 mL，使其最終體積為5 mL。藥液用PDA培養(yǎng)基45 mL混勻，使生物農(nóng)藥的最終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。將含有待測(cè)生物農(nóng)藥的PDA培養(yǎng)基平均倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 病菌接種。將活化好的輪斑病病菌置于超凈工作臺(tái)，用打孔器于菌餅邊緣打孔，制成直徑為 4.0 mm的菌餅，然后用無菌接種針按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求將菌餅接種到含有各生物農(nóng)藥的培養(yǎng)基中。最后將培養(yǎng)皿放于25℃、80%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。待空白對(duì)照組生長(zhǎng)至6.0 cm左右時(shí)，采用十字交叉法測(cè)試菌餅直徑[12]，計(jì)算其抑制率(I)，篩選出抗茶輪斑病活性較高的生物農(nóng)藥。

I=[(C-T)/(C-0.4)]×100%

式中，C為空白對(duì)照菌絲測(cè)量直徑，T為藥物處理組測(cè)量直徑。

1.3.2 活性較高生物農(nóng)藥抗茶輪斑病的EC50測(cè)定 根據(jù)5種生物農(nóng)藥對(duì)茶輪斑病抑制活性的初篩結(jié)果，在濃度100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL條件下，測(cè)定抑制活性較高生物農(nóng)藥的EC50，藥劑對(duì)照(CK1)為春雷霉素50～800 μg/mL、空白對(duì)照(CK2)為等量吐溫80滅菌水。利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌活性，采用十字交叉法測(cè)量生長(zhǎng)后的菌絲直徑，并計(jì)算抑制率，再對(duì)生物農(nóng)藥濃度取對(duì)數(shù)與其相應(yīng)抑制率進(jìn)行線性回歸分析，從而得出EC50。根據(jù)EC50判斷生物農(nóng)藥的毒力大小，即生物農(nóng)藥的EC50越小，對(duì)茶輪斑病病原菌的毒力越小。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種生物農(nóng)藥對(duì)茶輪斑病的抑制活性

從表2可知，在100 μg/mL濃度下，5種生物農(nóng)藥對(duì)茶輪斑病菌的抑制率以處理1最高，為78.74%；處理4其次，為67.48%；處理5第三，為58.72%；處理3最低，為4.32%；CK1為18.70%，除比處理3高外均低于其余處理，各處理的抑制率差異均達(dá)極顯著。說明，寡糖-乙蒜素、香菇多糖、申嗪霉素和嘧啶核苷類抗菌素4種生物農(nóng)藥對(duì)茶輪斑病菌的抑制活性均優(yōu)于對(duì)照春雷霉素，其中以寡糖-乙蒜素、香菇多糖的效果最好。

表2 不同生物農(nóng)藥抗茶輪斑病菌活性的抑制率

2.2 寡糖-乙蒜素、香菇多糖對(duì)茶炭疽病的抑制率及EC50

2.2.1 抑制率 從表3可知，寡糖-乙蒜素、香菇多糖和春雷霉素在各濃度下對(duì)茶輪斑病菌的抑制率均達(dá)極顯著差異，在試驗(yàn)濃度下均隨藥劑濃度減小對(duì)茶輪斑病的抑制率呈極顯著減小趨勢(shì)。在各濃度下抗茶輪斑病菌的抑制率以寡糖-乙蒜素最佳，濃度6.75～100 μg/mL的抑制率在20.20%～79.13%，比同梯度濃度下香菇多糖的抑制率分別高6.76百分點(diǎn)、12.28百分點(diǎn)、11.66百分點(diǎn)、12.26百分點(diǎn)和9.82百分點(diǎn)。寡糖-乙蒜素和香菇多糖在各濃度下的抑制活性均高于對(duì)照藥劑春雷霉素，其抑制率和對(duì)應(yīng)藥物濃度均呈較好的線性關(guān)系，測(cè)定的EC50值可信度高。

表3 寡糖-乙蒜素、香菇多糖不同濃度對(duì)茶輪斑病活性的抑制率

2.2.2EC50從表4可知，寡糖-乙蒜素、香菇多糖的毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均>0.95，說明濃度與抑制率間均存在良好的線性關(guān)系。寡糖-乙蒜素和香菇多糖的EC50分別為25.32 μg/mL和43.31 μg/mL，分別比對(duì)照藥劑春雷霉素的EC50(396.17 μg/mL)減少用藥量370.85 μg/mL和352.86 μg/mL。說明，寡糖-乙蒜素對(duì)茶輪斑病的毒力強(qiáng)度最大，香菇多糖其次，寡糖-乙蒜素、香菇多糖抗茶輪斑病的效果均優(yōu)于對(duì)照藥劑春雷霉素。

表4 寡糖-乙蒜素、香菇多糖對(duì)茶輪斑病病原菌的毒力回歸方程及EC50

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，在100 μg/mL濃度下，寡糖-乙蒜素、嘧啶核苷類抗菌素、丁子香酚、香菇多糖和申嗪霉素5種生物農(nóng)藥對(duì)茶輪斑病的抑制率，除丁子香酚外，其余4種均優(yōu)于對(duì)照藥劑春雷霉素(18.70%)，其中，以寡糖-乙蒜素的抑制率最高，為78.74%；香菇多糖其次，為67.48%，表明寡糖-乙蒜素和香菇多糖對(duì)茶輪斑病的抑制活性較佳。寡糖-乙蒜素、香菇多糖的EC50分別為25.32 μg/mL、43.31 μg/mL，分別比對(duì)照春雷霉素的EC50(396.17 μg/mL)減少用藥量370.85 μg/mL和352.86 μg/mL。說明，寡糖-乙蒜素對(duì)茶輪斑病的毒力強(qiáng)度最大，香菇多糖其次，生產(chǎn)上防治茶輪斑病建議使用寡糖-乙蒜素。