NOX2/4在肺纖維化發病機制中的作用

王波 李萬成

作者單位：610500 四川 成都，成都醫學院第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科

肺纖維化(Pulmonary fibrosis, PF)是一種慢性、進行性的纖維化性肺部疾病，其發病機制與氧化應激有關；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶，也稱NOX家族，是在生物膜上傳遞電子的蛋白質，其主要的生物學功能是生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)[1]。ROS是正常細胞代謝的產物，作為第二信使而為人所知，其主要功能是調節信號轉導和基因表達[2]。盡管ROS具有重要的生理功能，但當ROS水平超過機體抗氧化能力時，就會發生氧化應激，導致器官功能障礙[1]。正常的肺穩態需要細胞內和細胞外氧化劑和抗氧化劑之間的適當平衡，但在異常情況下，如吸煙、石棉纖維、藥物和輻射等，會刺激人體肺組織產生過多的ROS，使氧化劑產生和抗氧化防御失衡，從而導致肺纖維化的發生[3]。盡管目前肺纖維化的發病機制尚未完全明了，但氧化應激已是肺纖維化發生的一項重要機制。本文將對NOX2/4在肺纖維化發病機制中的作用進行綜述，旨在找到治療肺纖維化的新靶點。

ROS的產生、種類及功能

NOX2/4的生物化學結構及功能

NOX包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2，其中與器官纖維化相關的主要是NOX2和NOX4。NOX2與NOX4均包含一個同源COOH末端的黃素蛋白結構域(由一個NADPH結合區域和一個黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結合區域組成)以及一個疏水NH2末端結構域(由6個跨膜側螺旋結構組成，其中4個血紅素結合組氨酸位于第三和第五跨膜結構域)，其主要功能是生成ROS；并且其異構體的激活均涉及到與跨膜蛋白p22phox形成異源二聚體[1]。NOX2，也被稱為gp91phox，是由兩個大小相等但性質截然不同的主要域組成的。氨基端部分包括6個跨膜胞內螺旋，并由5個環連接，其中有3個環是細胞外環，有2個環是細胞內環[8]。NOX2與跨膜蛋白p22phox組成非活性異源二聚體。NOX2/p22phox復合物的激活需要4個細胞質亞基，即p47phox(組織者)、p67phox、p40phox和Rac1或Rac2的轉位酶；NOX2在吞噬細胞(中性粒細胞和巨噬細胞)中大量表達，結構細胞(間充質細胞、平滑肌細胞、內皮細胞和氣道上皮細胞)中也有少量表達[1]。NOX4具有組成活性，其結構與NOX2相似[8]；NOX4的578個氨基酸序列與NOX2(gp91phox)有39%的同源性，在跨膜區域以及血紅素、FAD和NADPH的結合位點上具有相對高度保守的基序,NOX4與膜蛋白p22phox形成異二聚體復合物，可增強其ROS的生成活性。在肺中，NOX4廣泛表達于各種類型的細胞中，包括巨噬細胞以及結構細胞(如平滑肌細胞、內皮細胞、間充質細胞和上皮細胞)[1]。

NOX2/4在肺纖維化發病機制中的作用

一、NOX2/4促進肌成纖維細胞活化及細胞外基質沉積

肺纖維化的特征是過量的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積在肺間質組織中，而肌成纖維細胞在ECM沉積中則起關鍵作用[9]；許多研究已經確認肌成纖維細胞是纖維化過程的建立和進展的細胞，纖維化疾病中的肌成纖維細胞起源于多種細胞來源，包括靜止的成纖維細胞、循環的CD34+纖維細胞，以及各種類型的細胞(包括上皮細胞和內皮細胞)，其轉換過程稱為上皮/內皮-間充質(EMT/EndMT)轉變；轉化生長因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)蛋白家族由多種多效生長因子組成，在胚胎發生、細胞發育和分化、免疫系統發育、炎癥反應功能和創傷修復等眾多生理過程中發揮重要作用。由于其強促纖維化作用，這些分子也參與了各種人類纖維性疾病的發病機制。TGF-β廣泛參與EMT/EndMT轉變，而NOX4在此過程中則作為一個重要的下游介質，參與激活靜止的成纖維細胞，或者將不同類型的細胞表型轉化為激活的肌成纖維細胞；此外，TGF-β也可有效地刺激NOX4基因表達和NOX4蛋白水平[10]；因此，NOX4可通過TGF-β促進EMT/EndMT轉變，使多種不同類型的細胞轉化為激活的肌成纖維細胞，從而促進ECM沉積。目前已有研究表明，可通過促進蛋白酶體降解抑制NOX4，從而抑制TGF-β誘導的肌成纖維細胞分化和肺纖維化的發展[11]。此外，NOX4生成的ROS也被證明參與肌成纖維細胞的激活，而且ROS可能有助于纖維原性分子的激活，如TGF-β1；有研究證據表明NOX4生成的ROS在成纖維細胞/肌成纖維細胞分化前的肺纖維化的發病步驟中發揮著重要作用[12]。另外，TGF-β可誘導NOX4表達并依賴于smad信號，提示TGF-β與NOX4表達之間可能存在自我放大的回路，并且通過二甲雙胍激活磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)，可抑制TGF-β誘導的NOX4表達和ROS的產生，從而抑制肌成纖維細胞的激活，減輕肺纖維化[13]，表明NOX4促進肌成纖維細胞的激活可能還與AMPK/smad信號通路有關。目前也有研究指出，介導肌成纖維細胞活化的ROS可來自肺泡巨噬細胞，且依賴于NOX2和NOX4；雷公藤中純化的二萜環氧化合物TPL可通過下調放射性纖維化小鼠肺泡巨噬細胞中NOX2和NOX4的水平，減輕ROS的產生，從而阻斷肌成纖維細胞的活化及減輕ECM的沉積[14]。由此可見，NOX2/4在參與肌成纖維細胞的活化及細胞外基質沉積中發揮著至關重要的作用。

二、NOX2/4促進肺上皮細胞損傷、凋亡

肺上皮細胞損傷在肺纖維化的早期發病機制中起著重要的作用；并且肺泡上皮的損傷和異常修復是肺纖維化開始的關鍵[15]；盡管上皮細胞在受損時具有自我修復功能，但是持續的上皮細胞損傷可導致肺纖維化的發展。因此，上皮細胞的損傷、凋亡具有重要意義，它不僅會造成肺泡-毛細血管屏障的受損，也會導致肺組織的異常修復而引起肺纖維化。NOX4可通過ROS介導TGF-β1誘導上皮細胞凋亡，并且使用選擇性抑制NOX2/4表達的化合物fulvene-5可降低TGF-β1誘導的上皮細胞凋亡，從而減輕肺纖維化；而在此過程中NOX4衍生的ROS被證明是TGF-β1誘導的肺泡上皮細胞凋亡的重要下游介質。但ROS可能也有上游作用，可通過促進TGF-β1的表達和激活，增加肺纖維化中NOX4和TGF-β1之間的正反饋作用[12]。另外，活化的肌成纖維細胞也可通過旁分泌H2O2介導上皮細胞凋亡；并且其可能通過氧化介導的機制，促進上皮細胞的周期性損傷及異常修復，從而導致器官的進行性纖維化[16-17]。此外，NOX4可能也有直接導致肺泡上皮細胞凋亡的作用[16]。

三、NOX2參與肺部炎癥反應

炎癥對纖維化的影響是多重的；在感染和損傷后，炎癥細胞和損傷組織細胞分泌可溶性介質(其中包括TGF-β)，誘發巨噬細胞和中性粒細胞分泌炎癥介質，進一步刺激TGF-β的產生和激活，導致持續的組織修復或器官纖維化。另外，嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞也會分泌促炎因子IL-13，而IL-13可刺激成纖維細胞活化和成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化從而導致纖維化的發生發展[18-19]。盡管NOX4在肺纖維化的發生發展中具有不可忽視的作用，但有研究表明NOX4不通過調節炎癥反應參與肺纖維化的發病機制[12，20]。目前，NOX2依賴的ROS在促進吞噬細胞的抗菌活性和介導炎癥反應方面發揮著公認的作用[1]。NOX2異構體廣泛表達，且穩定存在于肺中，炎癥狀態時其數量可明顯增多[21]。在囊性肺纖維化發病機制中，NOX2產生的ROS可介導炎癥介質的表達，參與囊性纖維化患者肺部早期炎癥反應[22]。此外，尚有研究結果表明，結晶二氧化硅誘導的肺纖維化組織中NOX2的表達呈時間依賴性增加，使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)灌胃后小鼠矽肺模型中升高的NOX2水平可明顯降低，并且其血漿及肺泡灌洗液中的炎癥介質水平也明顯降低，提示NOX2可能在肺部炎癥和纖維化中發揮重要作用[23]。如上文所述，NOX2需要和調控亞基p47phox、p67phox的結合才能形成有功能的NOX2；而從特發性肺纖維化患者肺泡灌洗液中分離的中性粒細胞顯示出p47phox和p67phox表達升高，提示NOX2在特發性肺纖維化患者的炎癥反應中具有某種潛在的作用[24]。

靶向NOX2/4藥在肺纖維化治療中的應用前景

盡管吡非尼酮與NAC都具有下調NOX4表達的作用[25]，并且我國在特發性肺纖維化的治療共識中推薦吡非尼酮聯合NAC治療肺纖維化，但吡非尼酮不良反應多，且發生較頻繁[26]；而對于NAC，其局限性更大且療效不顯著，推測其主要原因可能有三：一、是NAC雖可降低NOX4表達，但其對NOX2的影響則較弱，導致其抗氧化能力弱；二、是NAC可能易使ROS 與抗氧化劑相互作用失衡而導致其抗氧化劑效果不明確[25-27]；三、是NAC雖具有一定的抗氧化潛力，但它是一種比谷胱甘肽和大多數其他內源性抗氧化劑和酶弱得多的抗氧化劑，并且易水解為無抗氧化能力的胱氨酸，而且在充滿谷胱甘肽的細胞中，其NAC抗氧化能力就會失效[28]。因此，吡非尼酮與NAC在治療肺纖維化中，均具有較大的局限性。此外，目前也推薦使用尼達尼布用于肺纖維化的治療，但其不良反應也較常見，而且與吡非尼酮一樣，用于治療重度肺功能障礙的IPF患者，療效仍未可知[26，29]，且這兩種藥物在改善患者生活質量和治療肺纖維化方面的能力均有限[30]。因此，目前亟需尋找一種療效確切、不良反應少、在體內代謝穩定抗纖維化藥物。如本文所述，NOX2/4在肺纖維化的發生發展中發揮了不可忽視的作用，推測NOX2/4可能是治療肺纖維化的一個關鍵靶點，因此靶向NOX2/4藥在肺纖維化治療中應具有廣闊的應用前景。

綜上所述，肺纖維化的發病機制與氧化應激密切相關，NOX2/4通過ROS在促進肌成纖維細胞活化、ECM沉積、上皮細胞損傷、凋亡以及肺部炎癥中扮演著重要的角色；因此以NOX2/4為治療靶點，可能是治療肺纖維化的一個重要突破口。