慢病毒載體介導的miR-342-3p對非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲遷移的影響研究

朱亞蕊 時松和 李雪

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的類型，深入了解其生物學機制，開發有針對性的靶向藥物對提高晚期或轉移性非小細胞肺癌患者的總體生存率具有重要意義[1]。miRNA的異常表達與NSCLC密切相關，研究報道非小細胞肺癌患者的血清樣本中miR-342-3p表達顯著下調，miR-342-3p的低表達與晚期TNM分期和陽性淋巴結轉移密切相關[2]。且miR-342-3p過表達，可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移[3]。核酪蛋白激酶和細胞周期蛋白依賴性激酶底物1(nuclear ubiquitous casein and cyclindependent kinase substrate1，NUCKS1)在DNA損傷反應和代謝中起重要作用，可以用作多種癌癥的生物標志物；并與microRNA相關[4]。研究報道miR-137可通過負調控NUCKS1抑制肺癌A549細胞增殖，遷移，并使肺癌細胞對紫杉醇和順鉑敏感[5]。miR-342-3p是否通過調控NUCKS1影響非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲遷移還尚不清楚。因此，本研究旨在探討miR-342-3p是否通過調控NUCKS1影響非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲遷移。

資料與方法

一、一般資料

2017年5月至2020年5月經手術病理證實的非小細胞肺癌患者30例，其中男21例，女9例，年齡25～78歲，平均59歲。所有患者術前均未進行過放化療。通過手術切除其肺癌組織，選取癌旁健康的組織作為對照。

二、材料

人正常肺上皮細胞BES2A-2B和肺癌細胞A549、H1299購自美國ATCC；RPMI-1640培養基購自杭州仟諾生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自北京麥瑞博生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自上海圻明生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司；MTT試劑盒購自美國Sciencell公司；Transwell小室、Matrigel購自美國BD公司；慢病毒載體pLent-CMV-GFP購自武漢益普生物科技有限公司。

三、細胞轉染與分組

人正常肺上皮細胞BES2A-2B和肺癌細胞A549、H1299均用RPMI-1640培養基在37℃、5% CO2條件下培養，取對數生長期細胞進行實驗。

合成miR-342-3p特異性過表達片段，將其克隆至慢病毒載體pLent-CMV-GFP中，命名為LV-miR-342-3p；將LV-miR-342-3p和陰性對照空病毒載體分別轉染至A549、H1299細胞中，記為LV-miR-342-3p組和LV-NC組；未轉染任何質粒的細胞作為NC組。

四、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-342-3p和NUCKS1的表達水平

提取癌組織和細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，按照試劑盒說明進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。miR-342-3p和NUCKS1分別以U6和GAPDH為內參，miR-342-3p上游引物序列：5′-TCTCACACAGAAATCGC-3′，下游引物序列：5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；NUCKS1上游引物序列：5′-TGCCCAAACCCAGACTAAAG-3′，下游引物序列：5′-GACCCTTCATCCCCAGATTT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。

五、蛋白質印跡(Western blot)法檢測蛋白表達

提取細胞總蛋白，BCA定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜；加入二抗室溫孵育2 h，ECL發光液顯影，成像后用Quantity One分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參計算目的蛋白相對表達水平。

六、雙熒光素酶報告實驗檢測miR-342-3p和NUCKS1的靶向關系

構建NUCKS1 3′UTR的野生型和突變型熒光素酶表達載體NUCKS1 3′UTR-WT和NUCKS1 3′UTR-MUT，將其分別與miR-342-3p共轉染至肺癌細胞中；按說明書檢測熒光素酶活性。

七、MTT檢測細胞增殖活力

各組細胞分別培養0 h、24 h、48 h、72 h時，每孔分別加入20 μL MTT溶液，繼續孵育4 h，加入150 μL DMSO，振蕩反應10 min，用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度(OD)值。

八、Transwell檢測細胞遷移和侵襲

細胞遷移實驗：Transwell小室上室和下室分別加入200 μL細胞懸液和600 μL培養液，培養24 h，吸去培養液，用4%多聚甲醛固定后，再用0.1%結晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照，計算遷移細胞數。細胞侵襲實驗在Transwell小室上層加入50 μL基質膠Matrigel，凝固后接種細胞，之后同細胞遷移操作。

九、統計學分析

結 果

一、miR-342-3p在非小細胞肺癌組織和非小細胞肺癌細胞系中的表達水平

與健康組織比較，肺癌組織中miR-342-3p表達水平降低(P<0.05)；與人正常肺上皮細胞BES2A-2B比較，肺癌細胞A549和H1299中miR-342-3p表達水平降低(P<0.05)(見表1，2)。

表1 qRT-PCR檢測miR-342-3p在非小細胞肺癌組織中的表達

表2 qRT-PCR檢測miR-342-3p在非小細胞肺癌細胞系中的表達

二、NUCKS1在非小細胞肺癌組織和非小細胞肺癌細胞系中的表達水平

與健康組織比較，肺癌組織中NUCKS1表達水平升高(P<0.05)；與人正常肺上皮細胞BES2A-2B比較，肺癌細胞A549和H1299中NUCKS1表達水平升高(P<0.05)(見表3、4，圖1)。

圖1 Western blot檢測NUCKS1在非小細胞癌細胞系中的表達

表3 qRT-PCR檢測NUCKS1在非小細胞肺癌組織中的表達

表4 qRT-PCR檢測NUCKS1在非小細胞肺癌細胞系中的表達

三、miR-342-3p與NUCKS1直接相互作用

TargetScan預測顯示miR-342-3p與NUCKS1 3′UTR含有互補的核苷酸序列(圖2)。與NC組比較，miR-342-3p組轉染NUCKS1 3′UTR-WT載體的細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)(見表5)。

表5 雙熒光素酶報告實驗

圖2 miR-342-3p與NUCKS1的結合位點

四、miR-342-3p過表達慢病毒載體轉染非小細胞肺癌細胞對其miR-342-3p表達的影響

與NC組比較，LV-miR-342-3p組A549和H1299細胞中miR-342-3p的表達水平升高(P<0.05)(見表6)。

表6 qRT-PCR檢測NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉染A549和H1299細胞后細胞內miR-342-3p的表達水平

五、miR-342-3p負調控NUCKS1的表達，通過miR-342-3p的過表達來影響NUCKS1介導的非小細胞肺癌細胞的增殖，遷移和侵襲

與NC組比較，LV-miR-342-3p組A549和H1299細胞中NUCKS1的表達水平降低，細胞活力降低，遷移和侵襲細胞數降低(P<0.05)(見圖3，表7-10)。

圖3 Western blot檢測NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉染A549和H1299細胞后NUCKS1在非小細胞癌細胞系中的表達

表7 MTT法檢測轉染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉染A549細胞后對細胞活性的影響

表8 MTT法檢測轉染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉染H1299細胞后對細胞活性的影響

表9 Transwell小室檢測轉染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉染A549細胞后對細胞系遷移和侵襲的影響

表10 Transwell小室檢測轉染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉染H1299細胞后對細胞系遷移和侵襲的影響

討 論

研究報道miRNA參與了腫瘤的進展過程，肝癌組織中的miR-342-3p表達顯著降低，與TNM分期、組織學分級和不良的生存率相關，是肝癌預后的獨立預測因子[6]。本實驗檢測了肺癌組織及肺癌細胞A549和H1299中miR-342-3p表達水平，結果顯示，miR-342-3p表達水平降低，與其它研究結果一致。研究報道miR-342-3p過表達可抑制肝癌細胞的增殖[7]。miR-342-3p還可抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲[8]。miR-342-3p的異位表達顯著抑制了鼻咽癌細胞的增殖，集落形成和侵襲[9]。說明miR-342-3p在多種腫瘤中均有抑癌作用。為研究miR-342-3p對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用，本實驗構建了慢病毒介導的miR-342-3p過表達載體，將其轉染至肺癌細胞A549中，結果顯示，肺癌細胞A549中miR-342-3p表達水平升高，表明轉染成功。且細胞活力降低，遷移和侵襲細胞數降低；表明慢病毒介導的miR-342-3p可抑制肺癌細胞A549和H1299增殖、遷移和侵襲。本實驗研究結果表明miR-342-3p在肺癌中同樣起抑癌作用。

研究報道miR-342-3p可通過靶向LIM和SH3蛋白1(LIM and SH3 protein 1，LASP1)抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖[10]。說明miR-342-3p可通過調控其靶基因影響腫瘤的進展。為進一步研究miR-342-3p影響肺癌的分子機制，本實驗通過TargetScan預測顯示miR-342-3p可能的靶向結合mRNA，結果顯示miR-342-3p與NUCKS1 3′UTR含有互補的核苷酸序列。研究報道NUCKS1在肝癌組織中上調表達，敲低NUCKS1可降低異種移植小鼠模型中Hep3B細胞系細胞活力并減少腫瘤形成[11]。抑制NUCKS1可降低胃癌細胞增殖和侵襲性[12]。說明NUCKS1在肝癌和胃癌中可能起促癌作用，但其在肺癌的作用尚不清楚，本實驗檢測了肺癌組織以及肺癌細胞A549和H1299中NUCKS1表達水平，結果顯示NUCKS1表達水平升高，與在肝癌組織中表達趨勢相同，表明NUCKS1可能在肺癌中可能也充當癌基因。此外研究報道miR-142-3p通過靶向下調NUCKS1抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲[13]。說明NUCKS1可受miRNA的調控進而影響腫瘤進展，本實驗結果顯示，miR-342-3p過表達后NUCKS1表達水平降低；且進一步通過雙熒光素酶實驗證實了miR-342-3p可靶向調控NUCKS1。提示，miR-342-3p可能通過調控NUCKS1影響肺癌進展。