miR-200通過靶向PD-L1抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的研究

艾孜子·阿不來提 艾力江·多力坤 陳康

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的常見病理類型，多數患者發現時已經達晚期[1]。腫瘤細胞的遷移、侵襲在腫瘤的復發轉移過程中發揮重要的作用。因此，尋找到抑制NSCLC遷移、侵襲的靶點對于提高患者的預后尤為重要。microRNAs(miRs)是長度22nt 的內源性非編碼RNA，與靶基因相互作用后調控轉錄及轉錄后基因表達。有報道稱，miR-200作為抑癌基因，可抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲，促進凋亡[2-4]。戚永超等研究發現[5]，肺癌患者血清中miR-200水平低表達，與淋巴結轉移有關。但miR-200與NSCLC細胞的惡性生物學行為的關系尚不清楚。程序性死亡受體配體-1(Programmed death-ligand 1，PD-L1)屬于負性協同刺激分子，在免疫應答中起到負性調控作用[6]。研究發現，乳腺癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞PD-L1高表達患者預后良好，復發率低[7]。PD-L1還可以協助腫瘤逃避監視，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等[8]。張宇軒等研究發現，PD-L1下調后可促進非小細胞肺癌細胞的惡性生物學行為[9]。團隊前期通過在線網站分析發現，miR-200與PD-L1存在一定的互補堿基對，但兩者是否存在靶向關系尚不清楚。基于上述研究，本研究將miR-200 轉染到NSCLC細胞A549，探討miR-200對腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移的影響及機制，以期為NSCLC的治療提供靶點。

資料與方法

一、實驗材料

肺癌細胞株A549，正常肺成纖維細胞HLF-1(上海生命科學研究所)；杜氏改良伊格爾培養基( Dulbecco′smodified Eagle medium,DMEM)培養液、雙抗、胰蛋白酶(Biosciences，美國)；miR-NC、miR-200-mimic、si-NC、si-PD-L1、pEGFP、pEGFP-PD-L1、anti-miR-200、anti-miR-NC、MUT-PD-L1和 WT- PD-L1(上海生工生物有限公司)；LipofectAMINE 2000脂質體轉染試劑盒(BioVision公司，美國)；兔抗人PD-L1、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(Sigma公司，美國)；Transwell小室(上海鈺森生物有限公司)；MTT檢測試劑盒、RNA提取試劑盒(武漢博士德生物公司)；PCR試劑盒(Sigma公司，美國)；蛋白印記試劑盒(Kapa Biosystems，美國)；酶標儀(上海儀電分析儀器有限公司)；ABI 7900PCR擴增儀(上海儀電分析儀器有限公司)。

二、實驗方法

1 細胞培養、轉染及分組 用DMEM培養基培養A549，HLF-1細胞，培養基中加入含 10% FBS 和青、鏈霉素各 100U/L，培養條件：37 ℃，5% CO2，濕度飽和。定期更換培養基、傳代。A549細胞轉染：使用Lipofeetamine 2000試劑將miR-NC、miR-200-mimic、si-NC、si-PD-L1轉染至細胞內，繼續培養48h進行后續實驗。為驗證 miR-200通過下調PD-L1調控A549細胞的增殖、遷移和侵襲，將miR-200-mimic、pEGFP-PD-L1同時轉入A549細胞，進而觀察細胞生物學行為的改變。具體分組如下：NC組(未進行任何處理的A549細胞)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-200組(轉染miR-200-mimic)、si-NC 組(轉染si-NC)、si-PD-L1組(轉染si-PD-L1)、miR-200+pEGFP組(轉染miR-200-mimic+pEGFP)及miR-200+pEGFP-PD-L1組(轉染miR-200-mimic+pEGFP-PD-L1)。

2 實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測細胞miR-200、PD-L1 mRNA表達 使用Trizol試劑提取細胞總RNA，測定RNA濃度，將合格的總RNA轉錄成cDNA，然后進行PCR擴增。合成目標引物序列(北京華大基因公司)(見表1)，配置反應體系：SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)12.5μL+上下游引物10μM各1μL，加反應水至總體積為25μL。反應參數設置為92 ℃ 20 s、96 ℃ 2 s、85 ℃ 20 s、80 ℃ 6 s，共40個循環，75 ℃讀取熒光，構建溶解曲線。2-ΔΔCt法計算目標引物mRNA的相對表達量。

表1 目標引物序列和大小

3 熒光素酶實驗驗證miR-200與PD-L1的靶向關系 按照試劑盒步驟將PD-L1野生型或突變型的熒光素酶報告基因質粒載體與miR-NC、miR-200-mimic共同轉入細胞，培養48 h后去除培養液。PBS洗滌3遍，加入細胞裂解液。4 ℃振蕩10 min，40 ℃ 1 000 r/min離心3 min，取上清進行發光測定。

4 MTT法檢測細胞增殖能力 分別消化、收集各組細胞，調整濃度為5×106/L的單細胞懸液，接種于96孔板中，每組設置5個復孔，置于培養箱中0, 48, 72及 96 h，終止前每孔加入20 mL MTT，繼續培養4 h，上機前吸棄培養液，每孔加入150 mL DMSO，水平搖床搖動30min，在酶標儀(490 nm波長)上測量吸光度 OD值，并繪制細胞活力曲線。

5 Transwell小室實驗，檢測細胞遷移、侵襲能力 采用無Matrigel基質膠和有Matrigel基質膠的Transwell小室分別進行細胞遷移和侵襲實驗。遷移實驗：上室每孔加入200 μl無血清細胞懸浮液，密度為6×104個/孔，下室加入600 μl含20%血清培養液，培養48 h，4%多聚甲醛固定10 min，0.5 %結晶紫染色10 min。洗滌，光學顯微鏡下選取5個視野計算細胞數量。侵襲實驗：使用4 ℃的無血清DMEM 1 ∶6稀釋基質膠，每個transwell小室中加40 μL Matrigel基質膠，37 ℃放置30 min。取出小室吸取多余的液體，其余步驟同遷移實驗。

6 Western blot法檢測細胞PD-L1蛋白的表達 加2mL RIPA組織裂解液，勻漿，冰浴30 min，40 ℃ 500×g離心5 min，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μl待測。配膠，上樣，電泳，轉膜，切膜，封閉液封閉1 h，逐次大鼠抗人PD-L1(1 ∶100)、β-actin單克隆抗體(1 ∶100)、辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶100，武漢博士德生物有限公司)。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software測定光密度，結果以PD-L1與β-actin條帶光密度值比值表示相對表達量。

三、統計分析

結 果

一、A549，HLF-1細胞miR-200、PD-L1的表達

與正常肺成纖維細胞HLF-1相比，人肺癌A549細胞miR-200表達水平降低，PD-L1基因、蛋白表達升高(P<0.05)(見圖1)。

圖1 細胞miR-200、PD-L1的表達水平與HLF-1比較，*P<0.05

二、A549細胞miR-200與PD-L1的靶向關系

通過生物學信息軟件分析發現，miR-200與WT- 3′UTR-PD-L1存在一定數量的互補堿基對。熒光素酶實驗表明，轉染miR-200-mimic+WT-PD-L1的A549細胞熒光素酶活性低于轉染miR-NC+WT-PD-L1組(P<0.05)；與miR-NC+MUT-PD-L1組相比，轉染miR-200-mimic+MUT-PD-L1的A549細胞熒光素酶活性下降不明顯。miR-200組細胞PD-L1蛋白表達水平明顯低于miR-NC組(P<0.05)；anti-miR-200組細胞PD-L1蛋白的表達水平明顯高于anti-miR-NC組(P<0.05)(見圖2)。

圖2 miR-200與PD-L1的靶向關系與miR-NC組比較，*P<0.05； 與anti-miR-NC組，#P<0.05

三、過表達miR-200對A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響

miR-200組細胞miR-200水平顯著高于NC組、miR-NC組(P<0. 05)。48 和 72 h 時，miR-200組細胞活力明顯低于NC組、miR-NC組(P<0. 05)。miR-200組細胞遷移和侵襲數量明顯低于NC組、miR-NC組(P<0.05)(見圖3、4)。

圖3 過表達miR-200對細胞增殖的影響與miR-200組比較，*P<0.05

圖4 過表達miR-200對細胞遷移和侵襲的影響(20×)與miR-200組比較，*P<0.05

四、抑制PD-L1表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-PD-L1組細胞PD-L1 mRNA、蛋白水平顯著低于NC組、si-NC 組(P<0.05)。48 和 72 h 時，si-PD-L1組細胞活力明顯低于NC組、si-NC組(P<0.05)。si-PD-L1組細胞遷移和侵襲數量明顯低于NC組、si-NC組(P<0.05)(見圖5)。

圖5 抑制PD-L1表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響A、B 各組PD-L1蛋白水平；C 增殖能力檢測；D 遷移能力檢測；E 侵襲能力檢測; 與si-PD-L1組比較，*P<0.05

五、過表達PD-L1可逆轉過表達miR-200對A549細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

miR-200+ pcDNA-PD-L1組細胞PD-L1蛋白、mRNA均高于miR-200+pcDNA組、miR-200組(P<0.05)。miR-200+ pcDNA-PD-L1組細胞48、72 h時細胞活力、細胞遷移和侵襲數量高于miR-200+pcDNA組、miR-200組，差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖6)。

圖6 過表達PD-L1可逆轉過表達miR-200對A549細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用A:各組PD-L1蛋白水平；B:遷移能力檢測；C:侵襲能力檢測;D:增殖能力檢測. 與miR-NC組比較，*P<0.05；與miR-200+pcDNA組比較，#P<0.05

討 論

肺癌近年來發病率逐漸增加，且呈年輕化趨勢。腫瘤細胞的侵襲、轉移在肺癌預后不良及復發中發揮重要的作用。因此，如何抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移及轉移成為目前研究的熱點。

miRNA屬于高度保守的一種非編碼RNA，正常狀態下，miRNA的表達、降解過程遵循一定的規律，miRNA的異常表達可導致人類多種疾病的發生。miR-200作為最近發現的一種miRNA，廣泛參與了多種腫瘤細胞的惡性生物學行為，如王培云等研究發現，miR-200b、miR-200c可靶向調節肝細胞生長因子(HGF)抑制結直腸癌細胞的增殖[10]。李娟等研究結果顯示，miR-200b可上調調控PDCD4，從而抑制乳腺癌細胞的惡性生物學行為能力[11]。為明確 miR- 200對NSCLC細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響，在本實驗中，首先觀察了肺癌細胞株及人胚肺成纖維細胞中miR-200表達情況，結果顯示miR-200在肺癌細胞中低表達。隨后將miR-200-mimic轉染至A549細胞株，檢測了細胞增殖、侵襲及遷移能力，結果顯示，過表達miR-200細胞的增殖、侵襲及遷移能力明顯減弱，提示miR-200具有抑制NSCLC細胞惡性生物學行為的功能，這與其他腫瘤的相關研究基本一致。腫瘤細胞的遷移、侵襲是腫瘤細胞遠處轉移的基礎，肺癌作為一種惡性腫瘤，容易出現遠處的轉移，本次研究結果提示miR-200可能作為一種潛在的肺癌治療靶點。

PD-L1可介導多種腫瘤微環境的免疫抑制作用，在多種惡性腫瘤中高表達，而人體正常細胞幾乎不表達[12-13]。大量研究表明，PD-L1與前列腺癌、非小細胞肺癌、多發性骨髓瘤的預后、耐藥、復發等有關[14-16]。PD-L1活性的失活是抑制腫瘤發生免疫逃避的重要途徑。然而, miR-200和 PD-L1的靶向關系及其對肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響目前尚不清楚。因此本研究開展了以下實驗探討上述問題。本實驗首先觀察了不同細胞株PD-L1的表達情況，結果顯示A549細胞PD-L1基因、蛋白表達明顯升高。進一步研究發現，抑制PD-L1表達后細胞的增殖、遷移和侵襲能力減弱。PD-L1與其受體免疫細胞表面程序性細胞死亡受體-1(programmed cell death-1, PD-1)結合后可抑制細胞的免疫功能，“幫助”細胞逃脫免疫監視，促進腫瘤的惡性生物學行為。本次研究結果證實了上述理論的正確性，同時提示針對PD-L1的抑制劑有望成為肺癌治療的靶向藥物。隨后，熒光素酶實驗及PD-L1蛋白測定結果顯示，miR-200與PD-L1存在負性靶向調控的關系。最后團隊進行了功能回復實驗，結果表明，過表達PD-L1可逆轉miR-200對腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲的抑制功能，這更進一步證實miR-200可靶向調控PD-L1。但miR-200如何調控PD-L1的表達，具體通道尚需深入的探討。

綜上所述，過表達miR-200可抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲能力，這一過程與負性靶向調控PD-L1有關。但本次研究存在一定的局限性，如未對相關的相關信號通路進行研究，這也是下一步研究的重點。