305份國(guó)內(nèi)外小麥種質(zhì)條銹病與白粉病抗性鑒定與評(píng)價(jià)

王 鑫，宋鵬博，王笑笑，楊孟于，周 鋒，呂棟云，孫道杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物之一，其安全可持續(xù)生產(chǎn)對(duì)保障國(guó)內(nèi)口糧安全具有重要意義[1]。條銹病是一種由條形柄銹菌小麥專化型導(dǎo)致的氣傳性葉部病害[2]，白粉病是由禾布氏白粉菌小麥專化型侵染引起的氣傳病害，二者對(duì)小麥安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。由于病原菌生理小種變異頻繁，致使許多已有抗性基因喪失抗性，其中包括Yr1-Yr4、Yr6-Yr9、Yr17、Yr20-Yr22、Yr24-Yr29、Yr43、Pm2、Pm4a、Pm4b。因此，鑒定當(dāng)前種質(zhì)中的已知有效抗性基因，并結(jié)合小麥田間抗病表現(xiàn)明確其抗性水平，對(duì)于小麥抗病育種極為重要[3]。

傳統(tǒng)的抗性鑒定難以快速準(zhǔn)確地選擇具有特定抗性基因的小麥品種，隨著分子育種技術(shù)的不斷發(fā)展，利用與有效抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以對(duì)當(dāng)前的種質(zhì)資源進(jìn)行抗病基因檢測(cè)。劉理森等[4]，陳向東等[5]，李 瑋等[6]利用與抗白粉病基因或抗條銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)多份小麥種質(zhì)材料進(jìn)行了鑒定，篩選出了具有抗病的小麥種質(zhì)。病原菌生理小種與寄主抗性存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系[7]，篩選攜帶多效抗性基因及同時(shí)存在多數(shù)量單抗性基因的小麥種質(zhì)資源，對(duì)提高小麥綜合持久抗性具有重要意義。

本研究利用與兩個(gè)多效抗病基因Yr18和Yr46、三個(gè)抗條銹基因Yr10、Yr15和Yr26、三個(gè)抗白粉病基因Pm8、Pm21和Pm34緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)本課題組收集的305份國(guó)內(nèi)外小麥種質(zhì)資源進(jìn)行抗病基因檢測(cè)，以更好地了解抗條銹病及白粉病基因在小麥種質(zhì)材料中的分布情況，為小麥抗病育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的305份小麥種質(zhì)資源由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥育種實(shí)驗(yàn)室收集并保存，其中70份為國(guó)外品種(系)，其余為國(guó)內(nèi)地方種和審定品種。

1.2 成株期抗病性鑒定

將305份小麥材料種植在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)作站、南陽試驗(yàn)站和駐馬店駐研種業(yè)試驗(yàn)田，每個(gè)地點(diǎn)兩個(gè)重復(fù)，每個(gè)材料種植2行，行長(zhǎng) 2 m，行距25 cm，株距6.6 cm，用于病害等級(jí)調(diào)查(2020年乃近10年以來?xiàng)l銹病發(fā)病最重的年份)。于2020年4月下旬對(duì)田間小麥進(jìn)行成株期小麥條銹病和白粉病發(fā)病情況調(diào)查。小麥病級(jí)分為0、1、2、3、4共五級(jí)，抗性水平依次為免疫(0級(jí))、高抗(1級(jí))、中抗(2級(jí))、中感(3級(jí))、高感(4級(jí))[8]。每種病害在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分別調(diào)查2次，最終以所調(diào)查結(jié)果中最高等級(jí)為最終結(jié)果。

1.3 DNA的提取

采用CTAB法[9]提取小麥全基因組DNA，使用Thermo NanoDropTMOne/OneC超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA的濃度。

1.4 抗性基因檢測(cè)

1.4.1 多效抗病基因的檢測(cè)

利用兩個(gè)抗病基因Yr18和Yr46對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記Cslv34和CFD71進(jìn)行多效抗性基因檢測(cè)，引物見表1。PCR反應(yīng)體系(15 μL)為：2 μL模板DNA，7 μL Mix(DiNing),2 μmol ·L-1上、下游引物各1 μL(Sangon Biotech)，4 μL去離子水。標(biāo)記Cslv34的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min; 94 ℃變性40 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。標(biāo)記CFD71的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min; 95 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min， 73 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán); 73 ℃延伸5 min， 4 ℃保存。標(biāo)記Cslv34和CFD71的擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠在180 V下電泳檢測(cè),利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并拍照保存。

1.4.2 抗條銹病基因的檢測(cè)

利用標(biāo)記S26M47(Yr10)、Xbarc8(Yr15)和Xwe173(Yr26)對(duì)305份供試材料進(jìn)行抗條銹基因鑒定，引物見表1。三個(gè)標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系同1.4.1。標(biāo)記S26M47的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s，55 ℃退火 50 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸5 min， 4 ℃保存。標(biāo)記Xbarc8和Xwe173的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min; 94 ℃變性40 s， 59 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及其結(jié)果觀察同1.4.1。

1.4.3 抗白粉病基因的檢測(cè)

選用抗白粉病基因Pm8、Pm21和Pm34對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記AF1/AF4、SCAR1400/1000、Barc144對(duì)305份材料進(jìn)行檢測(cè)，引物見表1。三個(gè)標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系同1.4.1。標(biāo)記AF1/AF4和SCAR1400/1000的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s，62 ℃/55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。標(biāo)記Barc144的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min; 95 ℃變性1 min， 60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。標(biāo)記Barc144擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳及其結(jié)果觀察同1.4.1。標(biāo)記AF1/AF4和SCAR1400/1000的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)DuRed核酸染料染色后，在紫外凝膠成像儀內(nèi)觀察并拍照。

表1 用于檢測(cè)小麥抗條銹病及白粉病基因的分子標(biāo)記及其引物Table 1 Molecular markers and primersof resistance genes for wheat stripe rust and powdery mildew

2 結(jié)果與分析

2.1 多效抗病基因的檢測(cè)結(jié)果

305份種質(zhì)中，23份材料攜帶Yr18基因(圖1)，占比7.54%，包括碧螞1號(hào)、偃展4110、Norin 61、內(nèi)鄉(xiāng)5號(hào)、Aca 801、ProINTA Colibr 1、Lampo、Kanto 107、Nidera Baguette 10、襄麥55、中國(guó)春、揚(yáng)麥10號(hào)、CA1133、京冬22、秦農(nóng)151、Fr03717、Jagger/W94-244-132、CA0998、晉麥45、KNIISH 46、豐抗2號(hào)、NSA09-3645、CA0548。4份小麥種質(zhì)攜帶Yr46基因(圖2)，占比1.31%，包括小偃6號(hào)、川麥42、川麥43、鄂恩5號(hào)。

2.2 抗條銹病基因的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)305份材料進(jìn)行抗條銹病基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，共檢測(cè)到5份小麥種質(zhì)含有Yr10基因(圖3)，占比1.64%，分別為Mantol、NSA09-3645、STARSHINA、CA0548、內(nèi)鄉(xiāng)5號(hào)。在10份材料中檢測(cè)到Y(jié)r15基因(圖4)，占比3.28%，分別是魯麥5號(hào)、鄭州3號(hào)、洛旱2號(hào)、PH82-2、碧螞4號(hào)、寧麥9號(hào)、寧麥8號(hào)、Mason/Jagger、Aztec、TX03A0148。Yr26基因的STS標(biāo)記Xwe173未在305份小麥材料中擴(kuò)增出目的片段。

2.3 抗白粉病基因的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，在100份小麥材料中檢測(cè)到了Pm8基因(圖5)，占32.79%，分別是陜農(nóng)7859、陜麥509、石家莊15、衡7228、豫麥13、魯麥9號(hào)、煙農(nóng)18、魯麥14、淮麥20、陜354、中麥895、阜936、西農(nóng)291、85中33、新麥9408、泰山1號(hào)、豫麥21、西農(nóng)1376、皖麥33、周麥25、石4185、蘭考2號(hào)、中麥871、蘭考906、武農(nóng)148、魯麥8號(hào)、陜715、內(nèi)鄉(xiāng)188、臨抗12、周麥12、矮抗58、魯原502、高優(yōu)503、周麥30、豫麥7號(hào)、濟(jì)麥21、Dorico、Lampo、中育5號(hào)、小偃81、周麥32、中育9號(hào)、周麥18、石家莊8號(hào)、豫麥50、周8425B、周麥28、豫麥2號(hào)、Kitanokaori、周麥26、中麥875、周麥16、衡觀33、蘭考24、魯麥11、洛麥21、淮麥21、魯麥15、周麥11、金禾9123、魯麥7號(hào)、周麥22、豫麥35、中892、淮麥18、邯6172、晉麥61、周麥13、連麥2號(hào)、綿麥37、川麥46、川麥45、綿農(nóng)4號(hào)、川麥52、華2459、蓉麥4號(hào)、鄂恩5號(hào)、川麥107、#575(LYFENKO)/JAGGER/4/KARL*2//PI355520/、京冬17、科衡6654、農(nóng)大211、京冬22、SELYANKA、LASEN、農(nóng)大212、晉麥67、Fr03725、豆麥、Jagger/W94-244-132、 F98047 G14-2INC、輪選987、豐抗2號(hào)、CA1090、京冬8號(hào)、YANA、北京841、Lovrin13、PALPICH、寧冬10。只有在金禾9123中檢測(cè)到Pm21基因 (圖6)。

有95份小麥種質(zhì)含有Pm34基因(圖7)，占31.15%，分別為魯麥5號(hào)、偃展4110、豐產(chǎn)3號(hào)、陜農(nóng)7859、陜麥509、西農(nóng)979-005、鄭州3號(hào)、安1331、魯麥9號(hào)、魯麥14、西農(nóng)2000-7、宿0663、85中33、Barra、淄選2號(hào)、阿勃、小偃54、新麥9408、宿農(nóng)6號(hào)、石4185、濟(jì)麥22、11CA40、Norin 67、皖麥52、汶農(nóng)14、皖23094、豫麥49、陜優(yōu)225、洛旱2號(hào)、陜715、豫麥57、良星99、高優(yōu)503、陜229、皖麥50、Aca 601、泰山5號(hào)、Dorico、Lampo、周麥32、周麥23、陜農(nóng)981、山農(nóng)20、蘭考24、皖麥19、良星66、濟(jì)麥19、魯麥7號(hào)、臨旱2號(hào)、新麥19、中892、小偃22、淄麥12、西農(nóng)88、晉麥61、川麥44、連麥2號(hào)、綿麥37、襄麥55、鄂麥12、繁6、襄麥81、鎮(zhèn)麥6號(hào)、綿陽19、科成麥1號(hào)、川麥45、川麥42、綿農(nóng)4號(hào)、川麥52、綿陽26、川麥43、徐州25、內(nèi)麥9號(hào)、揚(yáng)麥15、綿麥185、川麥107、中麥175、CA1135、Fr03724、秦農(nóng)151、Fr03717、Thesee、LASEN、CA1119、Magnus、Fr03711、C39、F98047G14-2INC、晉麥45、RE714、NUWEST/4/D887-74/PEW/3/LNCR//CARSTEN/GIGANT/5/MRS/CI14482//YMH/HYS/3/RON、DEZVOUS、Fr3713、Festin、CA9719、Azulon。

2.4 小麥種質(zhì)中抗病基因的分布及其抗病性評(píng)價(jià)

表型鑒定發(fā)現(xiàn)，攜帶Yr18的23份材料中，對(duì)條銹病產(chǎn)生免疫的有3份(豐抗2號(hào)、Fr03717等)，高抗的有3份，中抗的有1份；對(duì)白粉病產(chǎn)生免疫的有6份(Nidera Baguette 10、揚(yáng)麥10號(hào)等)，高抗的有7份，中抗的有3份。其中小麥地方品種中國(guó)春攜帶Yr18，該種質(zhì)在小麥成株期對(duì)條銹病和白粉病都具有高抗水平。攜帶Yr46的4份材料中，川麥43、川麥42和小偃6號(hào)在成株期分別對(duì)條銹病產(chǎn)生免疫、高抗和中抗反應(yīng)；鄂恩5號(hào)和小偃6號(hào)對(duì)白粉病具有中抗抗性。其中小偃6號(hào)對(duì)條銹病和白粉病同時(shí)具有成株期中抗抗性。

抗條銹病基因中，攜帶Yr10的5份材料中，有1份(Mantol)表現(xiàn)為高抗，1份(CA0548)表現(xiàn)為中抗。攜帶Yr15的10份材料中，魯麥5號(hào)和TX03A0148表現(xiàn)免疫水平，Aztec表現(xiàn)出高抗。

對(duì)抗白粉病基因，攜帶Pm8的100份材料中，表現(xiàn)免疫的有24份(矮抗58、中麥871等)，高抗的有23份，中抗的有12份。攜帶Pm21的只有金禾9123表現(xiàn)為高抗。攜帶Pm34的62份材料中，表現(xiàn)免疫的有的21份(魯麥5號(hào)、川麥107等)，高抗的有28份，中抗的有13份。其他具有成株期抗病性的小麥種質(zhì)材料，未檢測(cè)到上述基因，可能由其他基因控制其抗病性。

2.5 抗病基因組合的分布及其抗病性評(píng)價(jià)

305份材料中，兩個(gè)多效抗病基因Yr18和Yr46分別檢測(cè)到23和4份材料。單抗性基因與這2個(gè)多效抗病基因有多種組合，共檢測(cè)到15份(表2)。其中Yr18+Pm8+Pm34組合1份(Lampo)，Yr46+Pm8組合1份(鄂恩5號(hào))，Yr46+Pm34組合2份(川麥42、川麥43)，Yr18+Yr10組合3份(內(nèi)鄉(xiāng)5號(hào)、NSA09-3645、CA0548)，Yr18+Pm34組合5份(偃展4110、襄麥55、秦農(nóng)151、Fr03717、晉麥45)，Yr18+Pm8組合3份(京冬22、Jagger/W94-244-132、豐抗2號(hào))。魯麥5號(hào)(Yr15+Pm34組合)和Fr03717(Yr18+Pm34組合)兩個(gè)小麥品種對(duì)條銹病和白粉病同時(shí)具有免疫或高抗水平的抗性。來源于北京的小麥材料CA0548同時(shí)含有Yr10+Yr18兩個(gè)抗條銹基因，對(duì)條銹病產(chǎn)生中抗水平。含有Pm8+Pm34組合的種質(zhì)有4份(陜麥509、Dorico、晉麥61、川麥107)，其對(duì)白粉病的抗性達(dá)到免疫水平。含有Pm21+Pm8組合的小麥材料只有河北的金禾9123，對(duì)白粉病抗性達(dá)到免疫。

表2 抗病基因聚合種質(zhì)及其抗病性Table 2 Polymeric germplasmswithdisease resistance genes and their disease resistance

3 討 論

在小麥抗病育種中，已經(jīng)正式命名的抗條銹病基因包括Yr1～Yr83[19-21]，在小麥及其近緣植物的65個(gè)基因座上定位了90多個(gè)抗白粉病基因及其等位變異[22-25]。然而由于白粉菌和條銹菌變異頻率高、毒性增長(zhǎng)快的特點(diǎn)，致使許多抗性基因?qū)Ξ?dāng)前流行的毒性生理小種失去抗性[26-27]。因此快速明確現(xiàn)有種質(zhì)資源的抗性水平及攜帶的抗性基因種類迫在眉睫。

本研究結(jié)果顯示，部分小麥材料攜帶多個(gè)被檢測(cè)基因，如Yr15+Pm34、Pm8+Pm21、Yr18+Pm8+Pm34，將其作為抗病材料進(jìn)行小麥抗性育種，可使抗性基因進(jìn)行正向累積或者使材料具備抵抗多種病害的能力[28]，從而提高小麥綜合抗病性。有110份種質(zhì)中未檢測(cè)到被測(cè)的8個(gè)基因，其中，有19份小麥種質(zhì)對(duì)條銹病表現(xiàn)出高抗或免疫，對(duì)白粉病表現(xiàn)出高抗或免疫的種質(zhì)高達(dá)56份，推測(cè)它們可能攜帶其他抗性基因，其中，濟(jì)寧16、Sagittario、Klein Flecha、魯麥6號(hào)、WGRC10/3/KS93U69 sib/TA2455//KS93U69/4/JAGGER、秦農(nóng)731、Fr03733、Darius、Soissons、洋小麥、MV LAURA等11份材料對(duì)條銹病和白粉病均表現(xiàn)出免疫，這些種質(zhì)多為國(guó)外引進(jìn)，且暫未其所攜帶抗性基因的報(bào)道，所以在以后的抗病育種工作中可以對(duì)其進(jìn)一步分析并合理利用。魯麥5號(hào)、陜麥509、Fr03717和川麥45等種質(zhì)對(duì)于小麥條銹病和白粉病的綜合抗性呈現(xiàn)高抗水平，并且在本研究中已經(jīng)明確它們所攜帶的抗性基因，充分利用這些具有優(yōu)良綜合抗性的種質(zhì)資源，可減少小麥生產(chǎn)中因病害造成的損失。

Yr18和Yr46是多效抗性基因，二者對(duì)于小麥銹病和白粉病均具有部分抗性[29- 30]。本研究中，檢測(cè)到攜帶Yr18基因的材料僅有23份，其中13份來源于國(guó)外，總體檢出率很低。這與前人研究結(jié)果基本相似，如董 娜等[29]在348份國(guó)內(nèi)小麥種質(zhì)中進(jìn)行Yr18基因檢測(cè)，檢出率僅為2.01%，李敏州等[31]在115份陜西小麥品種(系)只檢測(cè)到中研196、西農(nóng)023、西農(nóng)928等3個(gè)材料含有Yr18基因，薛文波等[32]在74個(gè)國(guó)內(nèi)主栽小麥品種里未檢測(cè)到Y(jié)r18基因。本研究中，只有4份種質(zhì)攜帶Yr46基因，3份表現(xiàn)出中抗以上的抗條銹性，僅鄂恩5號(hào)中感條銹病，具體原因有待進(jìn)一步分析。未檢測(cè)到同時(shí)攜帶這兩個(gè)多效抗性基因的材料。在305份材料中，抗白粉病基因Pm8和Pm34檢出率均高于Pm21，僅金禾9123攜帶Pm21基因。這與劉理森等[4]在241份小麥品種(系)中只檢測(cè)到金禾8431和俊達(dá)129攜帶Pm21基因的情況基本一致，說明現(xiàn)有小麥種質(zhì)存在該基因的種類和數(shù)量很少。作為重要的抗白粉病基因資源，在以后應(yīng)該合理利用且使之廣泛分布。一個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種需對(duì)多種病害具備抗性，所以我們應(yīng)選育出綜合抗性優(yōu)良的小麥種質(zhì)。董 娜等[8]在39份國(guó)外引進(jìn)的小麥種質(zhì)中只篩選出2份(澳阿優(yōu)1號(hào)和bermude)兼具條銹病和白粉病抗性的種質(zhì)資源。肖萬婷等[33]對(duì)66份四川省小麥區(qū)試品種(品系)的條銹病、白粉病和赤霉病等抗性鑒定和分析，得到17份種質(zhì)對(duì)白粉病和條銹病兼具抗性，但沒有一個(gè)小麥品種(品系)兼具三種病害的抗性。在本試驗(yàn)中，共檢測(cè)到15份兼具條銹病和白粉病抗性的國(guó)內(nèi)外小麥種質(zhì)，說明當(dāng)前的小麥種質(zhì)綜合抗性較差。

戴妙飛等[34]利用Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26基因?qū)CARDA的203份小麥種質(zhì)進(jìn)行了抗條銹病基因分析，認(rèn)為“一因多效”基因Yr18與Yr9和Yr17基因組合可以產(chǎn)生更高水平的抗性。本研究結(jié)果表明，多類型抗性基因組合可提高小麥的綜合抗病性。綜上所述，單個(gè)多效抗性基因與抗條銹基因或抗白粉病基因組合，可顯著提高小麥的綜合抗病能力。“一因多效”抗病基因是一種重要的基因資源，可在明確現(xiàn)有種質(zhì)資源所含抗病基因的基礎(chǔ)上，通過聚合育種的方式將多個(gè)多效抗病基因集中在一個(gè)品種上，從而增強(qiáng)小麥的抗病能力，減緩目前流行毒性生理小種的變異速度，以此保障我國(guó)小麥的安全生產(chǎn)。