黃尾鲴潰瘍綜合征的病原菌分離鑒定及病理學觀察

王榮華，劉益莎，符艷純，張潤春，周 勇，羅玉雙，劉 飛，陳中元

( 1.湖南文理學院，水生動物重要疫病分子免疫技術湖南省重點實驗室，環洞庭湖水產健康養殖及加工湖南省重點實驗室，常德市農業生物大分子研究中心，湖南 常德 415000；2.中國水產科學研究院 長江水產研究所，湖北 武漢 430223 )

黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)屬鯉科、鲴亞科、鲴屬，俗稱黃尾、黃片、黃瓜魚等，是一種底棲的中小型淡水魚類，在我國的長江、珠江和閩江等地區各溪流中均有分布[1]。黃尾鲴具有含肉率高、易捕撈、疾病少等特點，是水產養殖業中增養殖優質品種[2]。目前尚未見黃尾鲴疾病的相關報道，近年來，在湖南株洲地區某黃尾鲴苗種場養殖的黃尾鲴親魚大面積暴發潰瘍綜合征，嚴重影響親魚的繁殖與后期養殖。為探明株洲地區黃尾鲴潰瘍綜合征的病因，筆者采用傳統病原菌分離鑒定方法和藥敏紙片法，分離致病菌和篩選敏感的中草藥和抗生素，并通過組織切片技術觀察病理變化，以期為湖南株洲地區黃尾鲴潰瘍綜合征的防治提供基礎數據和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚：患病黃尾鲴采集自湖南省株洲市醴陵縣某黃尾鲴苗種場，體質量(240±20) g；健康黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)體質量(90±5) g，健康黃尾鲴體質量(150±5) g，均購自常德市龍港路菜市場。試驗前于水族箱中暫養7 d，水溫(28±1) ℃，充氣，按體質量的2%投喂普通配合飼料。

主要試劑：肉湯培養基(LB)、肉湯瓊脂培養基、腦心浸液培養基(BHI)和藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細菌16S rDNA基因擴增通用引物合成和DNA測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；PCR試劑盒和DNA Marker為生工生物工程(上海)股份有限公司產品；25種中草藥(連翹、魚腥草、穿心蓮、苦參、白鮮皮、五味子、陳皮、黃芩、秦皮、艾葉、烏梅、牡丹皮、黃柏、紫蘇葉、貫眾、蒲公英、板藍根、五倍子、馬齒莧、柴胡、蘇木、紫花地丁、黃連、金銀花、野菊花)購自常德市九芝堂大藥房；改良型蘇木精—伊紅染色試劑盒為Thermo公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離培養

取有典型癥狀的黃尾鲴親魚，用體積分數70%的酒精體表消毒后，無菌條件下，取肝臟、腹水及潰瘍病灶等組織涂布接種腦心浸液瓊脂平板，28 ℃恒溫培養24 h，挑取優勢菌落于肉湯瓊脂平板劃線純化3次后，使用20%的甘油，-80 ℃保存備用。

1.2.2 人工感染試驗

將純化菌株接種于LB培養基，28 ℃，180 r/min振蕩培養24 h，用無菌生理鹽水稀釋至1×107cfu/mL菌液備用。由于黃尾鲴生性急躁，加上實驗室養殖條件不佳，實驗室養殖難成活，因此選擇較溫和的小型魚類黃顙魚作為人工感染試驗魚[3]。將健康黃顙魚隨機分為4組，每組30尾，采用肌肉注射法，每尾黃顙魚注射0.2 mL密度為1×107cfu/mL的菌液。試驗組設3個平行，同時設生理鹽水對照組。控制水溫為(28±1) ℃，連續觀察14 d，并記錄患病癥狀和死亡情況，同時取瀕死黃顙魚內臟組織進行細菌再分離培養與鑒定，以確定致病菌。

1.2.3 病原菌鑒定

生理生化鑒定：生理生化鑒定采用Biolog全自動微生物分析系統進行鑒定，將分離的優勢菌株劃線接種于質量分數5% BUG的培養基上，28 ℃培養24 h，用無菌棉簽蘸取一定量的細菌至IF-A接種液中，搖勻后調整濁度計讀數為98%，以每孔150 μL加入到96孔GEN Ⅲ鑒定板中，于28 ℃培養24 h，用Biolog全自動微生物分析系統讀取生理生化結果并進行鑒定。

16S rDNA鑒定：采用16S rDNA 的通用引物，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTC AG-3′，反向引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′[4]。反應體系：2×Taq PCR Mix 預混液25 μL，引物27F和1492R各1 μL，HZ0416菌液3 μL，ddH2O補齊至50 μL。擴增條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 延伸10 min。PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果進行BLAST比對分析，通過ClustalW 2.1和MEGA 7.0 軟件采用鄰接法構建系統發育樹，自展法檢測設置為1000次。

1.2.4 藥物敏感性試驗

抗生素藥物敏感試驗：采用常規紙片瓊脂擴散法對常用8 種抗生素藥物進行敏感性測定。取100 μL密度為1×107cfu/mL的優勢菌株均勻涂布于肉湯瓊脂平板，并將藥敏紙片均勻布置于平板上，每個紙片之間的距離不小于2 cm，28 ℃培養24 h 后測定抑菌圈直徑大小，并根據杭州微生物試劑有限公司公布的藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準判斷藥物敏感性。

中草藥藥物敏感試驗：采用常規紙片瓊脂擴散法對常用25種中草藥進行敏感性測定。取2 g中草藥浸泡于30 mL體積分數95%乙醇中，常溫浸泡，每周搖勻晃動1次，浸泡100 d后，按每片藥敏紙片(厚度0.5 mm、直徑6 mm)10 μL藥液加至滅菌后烘干的空白藥敏紙片中，37 ℃ 烘干備用；對照藥敏紙片按每片滅菌空白藥敏紙片滴加10 μL體積分數95%乙醇后，37 ℃ 烘干。中草藥敏感性試驗操作方法同抗生素藥敏試驗，設置試驗組和對照組，試驗組在平板上均勻布置制備好的中草藥藥敏紙片，對照組布置對照藥敏紙片。敏感性判斷標準：抑菌圈直徑≥20 mm為極度敏感，以“+++”表示；抑菌圈直徑15～<20 mm為高度敏感，以“++”表示；抑菌圈直徑10～<15 mm為中度敏感，以“+”表示；抑菌圈直徑<10 mm為低度敏感或無抑制效果，以“-”表示[5-6]。

1.2.5 病理學觀察

取患典型潰瘍綜合征的病魚肝臟、脾臟、腎臟和病灶處肌肉等組織于體積分數10%甲醛溶液固定后，經體積分數30%～100%乙醇梯度脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋，以4～5 μm厚度切片，蘇木精—伊紅染色后，使用徠卡(Leica)高級顯微系統(DM3000)觀察組織病理變化并拍照。

2 結果與分析

2.1 流行病特征及臨床癥狀

黃尾鲴親魚潰瘍綜合征主要暴發于繁殖季節4月—6月初，水溫25～28 ℃，發病率和死亡率高，消毒藥物、殺蟲類藥物治療效果不佳。患病黃尾鲴主要表現為：反應遲鈍，獨游；體表不同部位出現大面積潰瘍，部分病魚潰瘍處深入內臟；鰭條充血、出血，并伴有爛尾現象。解剖可見：病魚腹腔有淡黃色積液；肝臟充血、出血，嚴重者呈糜爛狀；脾臟、腎臟紅腫，腸道內無食物(圖1)。

圖1 黃尾鲴潰瘍綜合征臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of ulcerative disease syndrome in X. davidia.魚體表面不同部位出現潰瘍癥狀(▲.背鰭基部；△.腹部；→.尾柄處)，爛鰭； b.病灶潰瘍深至內臟(▲)，肝臟充血(△)； c.肝臟糜爛(▲)，腹腔有淡黃色積液(△).a.typical ulcers are found in different parts of fish surface (▲.the ulcers in base of dorsal fin； △.in abdomen； →.in caudal peduncle) and fin rot; b.the ulcer is deep to the internal organ (▲), hyperemia and hemorrhage in liver (△); c.liver erosion (▲) and light yellow effusion in peritoneum (△).

2.2 優勢菌株分離

從黃尾鲴親魚病灶處和肝臟中分離1株優勢菌HZ0416，鏡檢為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀。LB培養基28 ℃培養24 h菌落大小約2 mm，圓形，表面光滑，形態飽滿，均質透明，呈乳白色或淡黃色。

2.3 人工感染試驗

肌肉注射感染24 h后，黃顙魚開始出現潰瘍癥狀；感染后3 d，黃顙魚開始出現死亡現象；14 d死亡率達86.7%(圖2)。主要表現癥狀為：黃顙魚不

圖2 黃顙魚感染HZ0416累積死亡率曲線Fig.2 The cumulative mortality of yellow catfish P. fulvidraco infected with HZ0416

同部位出現不同程度的潰爛(圖3a～b)，腹腔有帶血腹水，肝臟充血、出血(圖3c)，膽囊腫大，部分魚有腸充氣現象。同時從病魚的肝臟和病灶處也分離到菌株HZ0416，對照組黃顙魚體表和內臟均無任何明顯癥狀。

圖3 黃顙魚感染HZ0416菌株的臨床癥狀Fig.3 Clinical symptoms of yellow catfish P. fulvidraco infected with strain HZ0416a、b.魚體表面不同部位出現典型潰瘍癥狀(▲.腹部;☆.臀鰭基部)； c.肝臟糜爛充血(▲)，腹腔有帶血的腹水(☆).a,b.typical ulcers in different parts of fish surface (▲.the ulcers in abdomen; ☆.base of anal fin); c.hyperemia and erosion in liver (▲) and bloody ascites in peritoneum (☆).

2.4 優勢菌株鑒定

2.4.1 Biolog微生物自動分析系統鑒定

Biolog微生物自動分析鑒定系統檢測結果顯示，分離的菌株HZ0416為舒氏氣單胞菌(Aeromonasschubertii)，置信度高達81.7%，鑒定結果各評價參數為PROB=0.817，SIM=0.796，DIST=2.939。

2.4.2 16S rDNA鑒定

菌株HZ0416的16S rDNA測序獲得1338 bp序列，GenBank登錄號為MN239102。美國國立生物技術信息中心核酸序列BLAST同源性比對分析結果顯示，菌株HZ0416和舒氏氣單胞菌同源性最高，達99.4%。系統發育樹結果顯示，HZ0416菌株和舒氏氣單胞菌聚為一支，而后與嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、維氏氣單胞菌(A.veronii)聚為一簇，表明菌株HZ0416為舒氏氣單胞菌(圖4)。

圖4 菌株HZ0416基于16S rRNA基因序列的系統進化樹Fig.4 Phylogenic tree of strain HZ0416 based on 16S rRNA gene sequences

2.5 藥敏試驗

2.5.1 抗生素藥物敏感性

抗生素藥物敏感性試驗結果見表1，舒氏氣單胞菌HZ0416對慶大霉素和氟苯尼考高度敏感；對環丙沙星中度敏感；對卡那霉素、多黏菌素B、青霉素、克林霉素和妥布霉素具有耐藥性。

表1 菌株HZ0416對抗生素藥物敏感性試驗結果Tab.1 Antibiotic susceptibility test of the strain HZ0416

2.5.2 中草藥藥物敏感性

中草藥藥敏試驗結果顯示，五倍子醇提取液對舒氏氣單胞菌HZ0416的抑菌圈直徑達30 mm，顯示其對舒氏氣單胞菌HZ0416極度抑制效果；陳皮、牡丹皮中草藥醇提取液對舒氏氣單胞菌HZ0416具有高度抑制效果；魚腥草、穿心蓮、蒲公英、柴胡、苦參中草藥醇提取液對舒氏氣單胞菌HZ0416有較好抑制效果；而舒氏氣單胞菌HZ0416對白鮮皮、五味子、黃芩、烏梅、蘇木、金銀花、連翹、秦皮等17種中草藥醇提取液呈低度敏感或不敏感(表2)。

表2 菌株HZ0416對中草藥藥物敏感性試驗結果Tab.2 Herbal medicinal susceptibility test of the strain HZ0416

2.6 組織病理觀察

組織病理學結果(圖5)顯示，肌纖維斷裂、溶解，細胞堆積形成肉芽腫，大量炎癥細胞浸潤，同時病灶處細胞中可見細菌的團塊和細菌感染后細胞凋亡留下的細胞輪廓(圖5b)；脾臟實質性細胞空泡壞死，組織內有大量含鐵血黃素沉著，伴隨有炎性細胞浸潤(圖5d)；肝細胞腫脹，細胞多發生核固縮、破裂和溶解，細胞界限不清晰，并伴有充血、出血現象，組織內有大量含鐵血黃素沉著(圖5f)；腎小球囊壁細胞變性、壞死，上皮細胞增生，腎間質縮小，炎癥細胞浸潤(圖5h)。

圖5 黃尾鲴潰瘍綜合征病理組織學觀察Fig.5 The pathohistological observation of ulcerative disease syndrome in X. davidia.正常肌肉組織； b.肌肉潰瘍病灶處形成肉芽腫(▲)，肌纖維變性、壞死(★)，組織中可見細菌團塊(△)，炎性細胞浸潤(→)； c.正常脾臟組織； d.脾細胞有含鐵血黃素沉積(★)，實質性細胞空泡壞死(▲)，大量淋巴細胞和單核吞噬細胞浸潤(→)； e.正常肝臟組織； f.肝臟細胞腫脹，充血(▲)，有含鐵血黃素沉積(★)； g.正常腎臟組織； h.腎小球囊壁細胞變性、壞死，上皮細胞增生(★)，炎癥細胞浸潤(→).a.normal tissue section diagram of muscle; b.the granuloma in lesion of muscle ulcer (▲), muscle fiber degeneration, and necrosis (★), bacterial clumps are found in lesion (△) and inflammatory cells infiltration (→); c. normal tissue section diagram of spleen; d.hemosiderin deposits in spleen cells (★), vacuolar degeneration in the spleen cells (▲) and lymphocytes and monocytes cells infiltration (→); e. normal tissue section diagram of liver; f.swell, hyperemia (▲) and hemosiderin deposition in liver cells (★); g. normal tissue section diagram of kidney; h.necrosis in cells of Bowman′s capsule wall, epithelial cells hyperplasia (★) and inflammatory cells infiltration (→).

3 討 論

3.1 致病菌鑒定與分析

黃尾鲴具有易捕撈、抗病性強、生長快等特點，已成為當前水產養殖品種結構調整中首選的優良品種之一。目前尚未見黃尾鲴相關疾病的報道，筆者自患潰瘍綜合征的黃尾鲴親魚肝臟中分離到1株革蘭氏陰性短桿菌HZ0416。人工感染試驗結果顯示，菌株HZ0416感染黃顙魚表現的癥狀與黃尾鲴親魚自然發病癥狀相似，從瀕死黃顙魚肝臟中分離到相同病原菌，感染后死亡率高達86.7%，因而推測菌株HZ0416能引起黃顙魚潰瘍綜合征，從而推斷菌株HZ0416是湖南株洲苗種場黃尾鲴潰瘍綜合征的潛在病原菌。

目前報道的潰瘍綜合征病原菌主要為氣單胞菌屬中的殺鮭氣單胞菌(A.salmonicide)[7]、維氏氣單胞菌[8,9]、溫和氣單胞菌(A.sobria)[10]和豚鼠氣單胞菌(A.caviae)[11]等。筆者自患病黃尾鲴中分離到菌株HZ0416，并證明其能誘發黃顙魚潰瘍綜合征。進一步通過Biolog全自動微生物分析系統和16S rDNA序列分析，確定菌株HZ0416為舒氏氣單胞菌。舒氏氣單胞菌最早于1988年自人體膿腫、傷口等處分離，目前已是人—畜—魚的重要條件致病菌[12]，其能引起人腹瀉和患壞死性筋膜炎，并導致人體多器官功能衰竭而死亡[13-14]。舒氏氣單胞菌廣泛分布于淡、海水等環境中[15-16]，能引起烏鱧(Channaargus)[17-18]、淡紅墨頭魚(Garrarufa)[19]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[20]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[21]等發病致死，對水產養殖業危害較大。

3.2 發病原因分析

黃尾鲴潰瘍綜合征是株洲市近年來陸續發生的比較嚴重的傳染性疾病，主要表現為：病魚體表多處潰瘍，肝臟、脾臟、腎臟等組織紅腫，出血、充血。流行病學調查顯示，該病主要發生在親魚繁殖季節，初春溫度在22 ℃時開始發病，并出現零星死亡；當水溫達到28 ℃，發病達到高峰期。推測在4—6月親魚繁殖過程中，由于黃尾鲴性急喜跳[3]，因而在捕撈和集中高密度養殖期間親魚容易損傷體表，加上過冬后魚體免疫力低下，更容易使環境中普遍存在的舒氏氣單胞菌在體表創傷處附著和定殖，引發感染。隨著感染的加劇，舒氏氣單胞菌隨血液循環進入魚體內臟器官，進而患潰瘍綜合征[22]。組織病理學觀察結果顯示，舒氏氣單胞菌感染損傷魚體肌肉后，肌纖維斷裂、溶解，隨著感染的加深，侵染機體肝臟、脾臟和腎臟，引起肝臟、脾臟和腎臟組織出血、充血，實質性細胞凋亡、壞死，導致多組織器官功能受損，引發死亡。

3.3 敏感性藥物篩選

藥敏試驗結果顯示，舒氏氣單胞菌HZ0416對慶

大霉素、氟苯尼考和環丙沙星敏感；對卡那霉素、多黏菌素B、青霉素、克林霉素和妥布霉素具有耐藥性，與自烏鱧[18]和雜交鱧(C.maculata×C.argus)[23]中分離的舒氏氣單胞菌基本一致。另外，五倍子醇提取液對舒氏氣單胞菌HZ0416的抑菌圈直徑達30 mm，優于試驗中所選抗生素的抑菌效果，同時試驗結果顯示，陳皮、牡丹皮、柴胡、魚腥草、穿心蓮等對舒氏氣單胞菌HZ0416也具有較好的抑制效果。因此，五倍子可作為預防和治療潰瘍綜合征的候選藥物，替代抗生素的使用降低養殖環境中耐藥菌的產生。

4 結 論

自患典型潰瘍綜合征的黃尾鲴中分離鑒定1株致病性舒氏氣單胞菌，回歸感染試驗顯示，其對黃顙魚具有強致病性。黃尾鲴親魚潰瘍綜合征的發病原因可能是在拉網和繁殖過程中，魚體產生機械損傷，從而感染環境中的舒氏氣單胞菌，引起肝臟、脾臟和腎臟等實質性器官細胞凋亡、壞死，表現出功能障礙，最終死亡。氟苯尼考、五倍子等作為候選藥物防治該養殖場黃尾鲴潰瘍綜合征，同時在親魚培育中，應注意提高魚體免疫力，加強對該病的預防。