復合微生物凈水劑在仿刺參養殖中的應用

周文銘，李俐穎，孫欣宇，劉 玥，李 瑩，劉冰南

( 大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034 )

我國的水產養殖大致可分為粗養、精細養殖、高密度精細養殖[1]。自20世紀70年代開始，水產養殖產品的種類和產量不斷地增加[2]。仿刺參(Apostichopusjaponicus)作為重要的水產養殖品種，因豐富的營養價值而備受人們青睞。由于仿刺參屬于底棲生物，過大的養殖密度導致殘餌和仿刺參糞便堆積池底，經微生物厭氧發酵產生許多有害物質，從而影響仿刺參生長[3]。除此之外，集約化水產養殖的水環境中會殘留大量有機污染物，其在代謝分解過程中產生氮、磷等營養物質并積累，導致養殖水體富營養化水平升高[4]。

微生態制劑是緩解水產養殖水體污染等問題的一種綠色產品，可以調整水體菌群結構，維持水環境穩態，提升水產品產量和綜合質量[5-6]。當前，通過施用微生態制劑對養殖水體和水產動物消化道內的微生物群體進行干預，進而增進水產養殖動物健康，這已成為水產動物健康養殖中廣泛采用的重要舉措。與此同時，各類高效微生態制劑也不斷地被開發使用[7]。芽孢桿菌(Bacillus)和光合細菌是兩種凈水能力較強的微生物。芽孢桿菌具備頑強的生命力，有耐高溫、耐強堿等特點，并且能降解大分子有機物[8]。光合細菌是一類具有光能合成體系的微生物，能利用硫化物和氨等，在養殖水體的凈化中具有重要作用。

化學需氧量和氨氮含量是衡量水中污染物水平的重要指標，它們可在一定程度上反映水體受污染的程度[9]。另外，水體中微生物在厭氧環境下分解水中硫酸鹽，產生硫化氫釋放到水環境中，不僅對仿刺參有毒害作用，還會消耗池水中大量的溶解氧[10]。Xia等[11]在養蝦水體中投放了芽孢桿菌和光合細菌等益生菌后，檢測水質發現，芽孢桿菌、乳酸菌、光合細菌的數量比最初投放時有明顯增加，而致病菌減少約80%。投放微生態制劑后，水體中的氨氮質量濃度也有很大程度的降低，水產品產量大幅度提高[12]。陸家昌等[13]研究發現，光合細菌對亞硝態氮的產生有一定抑制作用，且可以降低水體中氨氮和化學需氧量的質量濃度。

雖然水產用微生態制劑產品越來越豐富，但現有的微生態制劑存在孢子成形率低、生長發育遲緩、菌體自溶等問題[14]。目前，市面上缺乏有針對性的微生物凈水劑產品，對復合微生物凈水劑的特性和效果也缺乏針對性的評估。因此，筆者針對水產養殖過程中的水體凈化問題，以水體化學需氧量、氨氮和硫化物含量為衡量指標，開發微生物凈水劑產品，并對其在仿刺參養殖過程中的水體凈化效果進行評價。

1 材料與方法

1.1 菌株

本試驗使用的芽孢桿菌BS1和光合細菌PSB1(Rhodopseudomonaspalustris)均分離自瓦房店仿刺參養殖池塘。這2株菌在前期試驗中發現具有較強凈水能力[15]，且屬于農業部《飼料添加劑品種目錄(2013)》中的微生物添加劑，能夠應用于水產養殖。

1.2 培養基

LB肉湯培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，海水1 L，搖勻充分溶解后，將pH調整至6.8～7.0。

1.3 飼料成分

飼料購自大連博仕奧生物科技有限公司，飼料(含有鼠尾藻、粗蛋白、粗脂肪、礦物質、微量元素、水分、灰分等)與海泥的最終質量比為1∶1。

1.4 配制試劑

(1)人工硫化物污水：葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀0.75 g，磷酸二氫鉀0.25 g，硫酸亞鐵0.1 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸錳0.01 g，硫化鈉1.5 mg，海水1 L，搖勻充分溶解。

(2)人工氨氮污水：葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀0.75 g，磷酸二氫鉀0.25 g，硫酸亞鐵0.1 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸錳0.01 g，氯化銨13.37 mg，海水1 L，搖勻充分溶解。

(3)人工化學需氧量污水：葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀0.75 g，磷酸二氫鉀0.25 g，硫酸亞鐵0.1 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸錳0.01 g，鄰苯二甲酸氫鉀2.13 mg，海水1 L，搖勻充分溶解。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌液配比優化

將光合細菌PSB1和芽孢桿菌BS1的菌液分別按密度比1∶1、1∶2、2∶1的比例配制為混合菌液，將3種配比的混合菌液分別接種到配制完畢且經過滅菌處理的上述3種模擬人工污水水樣中，測定菌液對人工污水中化學需氧量、氨氮、硫化物成分的降解能力。采用國家標準GB 17378.4—2007《海洋監測規范第4部分：海水分析》[16]對人工污水樣本中化學需氧量(堿性高錳酸鉀法)、氨氮(靛酚藍分光光度法)、硫化物(亞甲基藍分光光度法)3個指標進行測定。污水水樣每隔2 d測量1次，測量周期為13 d。其中配制試驗用人工化學需氧量污水總體積3 L，每次檢測取樣量100 mL；人工氨氮污水總體積1 L，每次取樣量35 mL；人工硫化物污水總體積6 L，每次取樣量為200 mL。每個指標檢測設3個平行樣本，測定步驟嚴格按照國家標準GB 17378.4—2007規定進行操作，記錄數據。經過比對分析，從中確定凈水效果最佳的混合菌液配比，并利用該菌液配比作為后續仿刺參養殖試驗投菌配比。

1.5.2 菌液安全性試驗

為確定試驗中的復合微生物凈水劑是否符合國家標準，依據中華人民共和國農業行業標準NY/T 1444—2007《微生物飼料添加劑技術通則》[17]中的規定對復合微生物凈水劑進行相關的鑒定檢測，菌液檢測指標包括黃曲霉素B1[18]、志賀氏菌(Shigella)[19]、霉菌總數[20]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[21]、大腸菌群[22]、沙門氏菌(Salmonella)[23]以及砷[24]、汞[25]、鎘[26]、鉛[27]。具體檢測方法以及檢測樣本量均遵循《微生物飼料添加劑技術通則》[17]的規定進行操作。

1.5.3 仿刺參養殖試驗

試驗選用大連市瓦房店地區的稚參期仿刺參為試驗對象。為讓仿刺參適應實驗室養殖環境和餌料，試驗前對仿刺參進行預飼養7 d，選取規格相近的仿刺參均分至每缸中，每缸飼養約40頭，并滿足每缸養殖所需海水45 L，每頭仿刺參體質量(5±1.32) g，每日17：00時對仿刺參飼喂餌料1次，試驗期間缸內持續通入空氣，且保證水中溶解氧水平不低于6 mg/L，維持水溫在14～16 ℃。仿刺參養殖試驗期間，對復合菌劑在不同pH和鹽度條件下對養殖水體中氨氮、硫化物以及化學需氧量增長幅度的控制效果進行測量分析。養殖過程中試驗組以光合細菌與芽孢桿菌2∶1混合密度配比投放，并分別在不同pH梯度(7.0、7.5、8.0、8.5)和鹽度梯度(25、30、35)條件下進行試驗，空白對照組只投放基礎餌料，不加菌液，每組設3個平行。預飼7 d后，調整梯度再投加菌液不換水，喂養14 d(菌劑量為105cfu/cm3)，測量每組水體樣本中氨氮、硫化物質量濃度以及化學需氧量的變化情況，檢測方法與1.5.1中對人工污水中化學需氧量、氨氮、硫化物指標的檢測方法相同。

1.5.4 生長參數測定

篩選規格相近的仿刺參樣本進行分組養殖試驗，養殖方式同1.5.3。其中對照組僅飼喂餌料，試驗組除飼喂餌料外投放光合細菌PSB1與芽孢桿菌BS1混合密度比例為2∶1的復合微生物凈水劑。養殖過程中水體條件滿足pH 8.0、鹽度35，且每組各設3個平行，每缸仿刺參樣本30頭。對照組仿刺參初始體質量為(5.02±1.10) g，試驗組初始體質量為(4.99±0.97) g，養殖周期為14 d，記錄各組仿刺參體質量變化情況。質量增加(m，g)及特定生長率(RSG，%/d)按下式計算：

m=mt-m0

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，mt為仿刺參終末體質量(g)，m0為仿刺參初始體質量(g)，t為時間(d)。

1.5.5 數據分析

試驗數據以平均值±標準差表示，并用統計軟件SPSS 17.0進行單因素方差分析，不同處理之間采用LDN多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菌液混合最優比

本試驗測定了不同密度配比混合菌液對人工污水中氨氮、硫化物以及化學需氧量的降解能力。在未接菌的人工污水中，初始氨氮質量濃度為4.68 mg/L，初始硫化物質量濃度為0.62 mg/L，初始化學需氧量為4.02 mg/L(圖1)。在測量周期結束后，經測量得出當光合細菌PSB1與芽孢桿菌BS1復合菌液密度配比為1∶1時，人工污水氨氮質量濃度降至(0.54±0.15) mg/L，硫化物質量濃度降至(0.31±0.06) mg/L，化學需氧量降至(2.56±0.42) mg/L；當光合細菌PSB1與芽孢桿菌BS1復合菌液的密度配比為1∶2時，人工污水中氨氮質量濃度降至(0.59±0.33) mg/L，硫化物質量濃度降至(0.20±0.13) mg/L，化學需氧量降至(2.99±0.09) mg/L；當光合細菌PSB1與芽孢桿菌BS1復合菌液密度配比為2∶1時，最終人工污水中氨氮質量濃度降至(0.39±0.15) mg/L，硫化物質量濃度降至(0.26±0.05) mg/L，化學需氧量降至(2.35±0.37) mg/L。由圖1可見，3種比例的復合微生態凈水劑對氨氮、硫化物、化學需氧量均有一定程度的降解能力，其中對氨氮的降解效果更明顯，且混合密度配比為2∶1時，最終氨氮質量濃度相對較低，但三者差異不顯著(P>0.05)。對硫化物的降解能力的測量結果顯示，在投入復合微生態菌劑0～5 d時，硫化物質量濃度下降明顯；而自第7天起，硫化物質量濃度有所增加；根據測量數據得出，當復合菌劑密度配比為2∶1時，硫化物下降較多，但三者差異不顯著(P>0.05)。在對化學需氧量降解能力的測量結果顯示，在投入3種不同配比的復合菌劑的第5天開始，化學需氧量的變化較為明顯，光合細菌PSB1與芽孢桿菌BS1的混合密度比例為2∶1時下降顯著(P<0.05)。通過對混合菌液最優配比的測定試驗得知，光合細菌PSB1與芽孢桿菌BS1混合密度配比為2∶1時凈水效果較為理想。

圖1 人工污水中氨氮、硫化物質量濃度和化學需氧量變化Fig.1 The changes in levels of ammonia nitrogen, sulfide and COD in artificial wastewater

2.2 復合微生物凈水劑安全性

根據中華人民共和國農業行業標準NY/T 1444—2007《微生物飼料添加劑技術通則》[17]對復合微生物凈水劑進行相關指標檢測，檢測結果見表1。試驗中對復合微生態制劑的安全性作出評估，所檢測的10個衛生指標均符合標準。

表1 菌劑安全性指標Tab.1 Safety index of the microbial water purifier

結果顯示，在復合微生物凈水劑中檢測出含有砷、鎘2種成分，其中砷含量為0.017 mg/kg、鎘含量為1.634×10-4mg/kg，檢測結果均低于國家標準中規定的指標含量，除此以外的其余檢測項目均未在復合微生物菌劑中檢出。由此得出，本試驗提出的光合細菌與芽孢桿菌的復合微生物凈水劑符合NY/T 1444—2007《微生物飼料添加劑技術通則》[17]中的規定。

2.3 復合微生物凈水劑適用pH和鹽度范圍

測定在相同鹽度不同pH條件的仿刺參養殖水體中氨氮、硫化物和化學需氧量的質量濃度變化情況，結果見圖2，仿刺參養殖水體的初始氨氮質量濃度為1.3×10-4mg/L，硫化物質量濃度為2.57×10-3mg/L，化學需氧量為2.35 mg/L。投放混合菌液后，pH 8.5的試驗組氨氮質量濃度的上升幅度與對照組無顯著差異，而其他試驗組數據顯示較為平穩，上升幅度不顯著，抑制氨氮質量濃度升高的能力較強(P<0.05)。此外，試驗組的硫化物質量濃度上升幅度均比對照組低。第8天時，試驗組的硫化物質量濃度均顯著低于對照組(P<0.05)，但第10天時，pH 8.0和pH 8.5試驗組硫化物質量濃度升高較明顯。各組化學需氧量均呈升高趨勢，而pH 7.5時混合菌液對化學需氧量增長幅度的抑制作用顯著(P<0.05)，且顯著低于對照組。

圖2 不同pH養殖水體中氨氮、硫化物質量濃度和化學需氧量變化Fig.2 The changes in levels of ammonia nitrogen, sulfide and COD in aquaculture effluent with different pH

在相同pH條件下，3種不同鹽度梯度(25、30、35)的仿刺參養殖水體中氨氮、硫化物、化學需氧量的含量變化情況見圖3，3個試驗組的氨氮質量濃度均明顯低于對照組。所有試驗組與對照組中，隨時間變化氨氮質量濃度均呈持續升高趨勢，且在前4 d氨氮質量濃度差異不顯著(P>0.05)，但第6天之后，各試驗組中氨氮質量濃度上升緩慢，且在鹽度為35的試驗組中氨氮質量濃度上升幅度最小。

圖3 不同鹽度養殖水體中氨氮、硫化物質量濃度和化學需氧量變化Fig.3 The changes in levels of ammonia nitrogen, sulfide and COD in aquaculture water with different salinities

養殖水體硫化物檢測結果顯示，未投放菌劑的對照組硫化物質量濃度不斷升高，3個不同鹽度的試驗組在2～6 d內控制硫化物的能力較強，鹽度35試驗組中硫化物質量濃度上升幅度最小(P<0.05)。投放復合微生物凈水劑后，對照組和鹽度25試驗組化學需氧量升高幅度較大，而鹽度35試驗組的化學需氧量增加程度最為平緩，且自第3天起，該復合微生物凈水劑控制化學需氧量上升的效果最顯著(P<0.05)。

綜上所述，通過在不同pH和鹽度條件下對仿刺參養殖水體投放本試驗中的復合菌劑并與對照組進行對比，可以得出，本試驗中的復合微生物凈水劑能對養殖水體中氨氮、硫化物質量濃度和化學

需氧量起到一定的控制作用。該復合微生物凈水劑適用范圍較寬，在不同的海水pH和鹽度下，均能起到較好的降解作用，從而對仿刺參養殖水體有很好的凈化作用。

2.4 復合微生物凈水劑對仿刺參生長性能的影響

養殖試驗結束后，對各組仿刺參體質量進行稱量，并計算各組仿刺參的質量增加及特定生長率，結果見表2，復合微生物凈水劑處理組仿刺參質量增加和特定生長率均顯著高于對照組。可以看出，該復合微生物菌劑不僅具有凈化水質的效果，還對仿刺參生長有一定促進作用。

表2 復合微生物凈水劑對仿刺參生長性能的影響Tab.2 Effect of compound microbial water purification agent on thegrowth performance of the sea cucumber A. japonicus

3 討 論

3.1 復合微生物凈水劑凈化養殖水體作用機制

本試驗中復合微生物凈水劑是光合細菌與芽孢桿菌的混合物，二者的單一型凈水劑均在水產養殖中得到應用。光合細菌具有消除污染、凈化水體的作用；其在養殖水體內，可利用硫化氫或小分子有機物作為供氫體，同時也能將小分子有機物作為碳源，以含氮化合物、氨基酸等作為氮源利用。因此將其施放在養殖水體后可迅速消除氨氮、硫化氫和有機酸等有害物質，改善水體水質[28]。芽孢桿菌具有多種胞外氧化酶系，能降解水中有機廢物，迅速礦化為無機物，特別是能將一些大分子有機物降解為小分子，從而被光合細菌等僅能利用小分子糖類的微生物所利用，有效促進養殖水體的良性循環[29]；此外，芽孢桿菌還可以與養殖環境中的有害藻類及水產致病菌競爭，形成優勢種群，抑制有害藻類及水產致病菌[30-31]。本試驗充分利用光合細菌與芽孢桿菌具有凈水能力的特點，對在不同條件下兩種菌株配制的復合微生物凈水劑的凈水能力進行對比分析，得到實驗室制備的光合細菌與芽孢桿菌復合微生物凈水劑的最佳混合配比，以及理想的凈水條件，使復合菌劑凈水效果最大化。

3.2 復合微生物凈水劑使用條件的優化

有研究表明，光合細菌與芽孢桿菌協同凈化作用明顯[32]；姜海明等[33]認為，光合細菌和芽孢桿菌混合后可對烏鱧(Channaargus)養殖水體起到較好的凈化作用；李君華等[34]認為，二者以一定比例混合可提高仿刺參的免疫能力。以上研究均表明，光合細菌與芽孢桿菌混合使用凈水效果均優于單獨使用。但不同復合微生物菌劑凈水效果最佳的使用條件各有差異，因此尋找出這兩種菌最佳混合配比，對其適合的使用條件進行研究，并對該復合微生物凈水劑進行產品品質檢測，可以獲得該凈水劑的實際凈水能力，以判斷其是否符合作為微生物凈水產品的標準。

通過人工污水試驗證明，光合細菌與芽孢桿菌按照2∶1密度配比配制時其凈水效果最佳。在驗證其對人工污水中氨氮、硫化物以及化學需氧量有明顯的降解能力后，進行仿刺參養殖試驗，對不同條件下的復合菌劑凈水效果進行進一步探究。試驗結果表明，該復合微生物凈水劑在仿刺參喂養期間，對水體中不斷增加的氨氮、硫化物、化學需氧量均具有一定的降解作用，從而起到對水質的凈化作用。此外，復合微生物凈水劑在水體鹽度25～35時對水中氨氮、硫化物、化學需氧量均有一定的去除效果，而在pH 7.0～8.5時，復合微生物凈水劑對仿刺參養殖水體中氨氮、硫化物和化學需氧量去除效果較為理想。通過對中華人民共和國農業行業標準NY/T 1444—2007《微生物飼料添加劑技術通則》[17]規定的復合微生物凈水劑相關指標進行檢測，證明本試驗中的復合微生物凈水劑產品滿足作為微生物飼料添加劑行業標準。因此，本微生物凈水劑適用于多種海水養殖環境，對仿刺參等海產品的綠色養殖和水體環境凈化有重要作用。

4 結 論

筆者開發了光合細菌與芽孢桿菌按照密度配比2∶1配制的復合微生物凈水劑，在驗證其對人工污水中氨氮、硫化物以及化學需氧量有顯著的降解能力后，將其應用于仿刺參養殖中。試驗結果表明，該復合微生物凈水劑在仿刺參喂養期間對水體中不斷增加的氨氮、硫化物、化學需氧量具有一定的降解作用，從而起到水質的凈化作用。此外，在水體pH 7.0～8.5，鹽度25～35時，復合微生物凈水劑對氨氮、硫化物和化學需氧量均有較好的降解作用。檢測養殖期間仿刺參生長性能指標發現，該凈水劑對仿刺參生長有一定促進效果。