一株中低溫除硫防腐菌的開發與分子鑒定

吳偉林，孟章進，姜桂英，王 彪，楊 帆

（1.中國石化江蘇油田分公司人力資源部；2.中國石化江蘇油田分公司石油工程技術研究院；3.江蘇省油氣微生物工程研究中心，江蘇揚州，225009）

隨著油田開發進入中后期，綜合含水持續上升，油田系統有害微生物硫酸鹽還原菌大量滋生，產生大量的硫化物和硫化氫，帶來安全隱患，引起腐蝕結垢，造成油井頻繁檢泵作業，引起水質惡化，影響注水開發，硫酸鹽還原菌和硫化物的治理尤為迫切［1］。大量研究表明反硝化細菌對硫酸鹽還原菌有很好的競爭抑制［2］，其原理在于改變系統生存環境，包括氧化還原電位（Oxidation—Reduction Potential，ORP）、pH值、有機質等，使其不利于硫酸鹽還原菌的生長。隨著反硝化細菌抑制硫酸鹽還原菌技術在國外油田成功應用，國內油田開展利用微生物來抑制或消除微生物腐蝕的生物控制技術研究越來越受到重視［3-5］。油田系統環境中的微生物往往是獲取目標菌株的重要場所，而菌株的除硫效率會影響對硫酸鹽還原菌的競爭抑制和油田管道設備的防腐效果。為加強油田微生物在地面污水系統的應用，開展了中低溫除硫防腐菌的分離、篩選與鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

菌源：采集自JS油田不同水樣。水樣共計9份，編號分別為W2三相分離器出口、H4三相分離器出口、H88-1、H88-10、H88-31、W2-87、W15-17、W2-53、W11-1。以采樣中微生物為菌源，分離具有除硫防腐功能的微生物。

培養基：0.2%NaNO3，0.1%葡萄糖，0.1%硫酸鎂，0.5%蔗糖，0.1%酵母粉，0.5%磷酸二氫鉀。

1.2 除硫防腐菌富集

不同樣品中取水樣100 mL，采用高速離心（12 000 r/min，15 min）對水樣中微生物進行濃縮。去除上清液，沉淀用2 mL無菌水懸浮后，取1 mL懸浮液70℃水浴30 min以定向篩選對高溫具有耐受能力的除硫防腐菌。將高溫處理和未處理的懸浮液分別加入預先滅菌的選擇性液體培養基中，置40℃恒溫搖床180 r/min震蕩培養48～96 h，觀察培養液是否渾濁，獲得樣品培養富集液。光學顯微鏡染色觀察分離微生物的形態。

1.3 除硫防腐菌的分離純化及形態觀察

用涂布法將高溫處理的富集培養液均勻涂布于選擇性培養基上，40℃恒溫培養2～3 d，挑取單菌落接種到分離純化培養基上，采用劃線法進行分離純化，培養12 h后，挑取單菌落涂布于選擇性培養基上，獲得純化的除硫防腐菌分離菌株，平板結合顯微鏡檢觀察分離除硫防腐菌菌株的形態，確定優勢菌株供進一步研究。

1.4 除硫防腐菌的分子生物學鑒定

設 計16S rDNA通 用 引 物（Primer A：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Primer B：5’-GCTACCTTGTTACGACTT-3’），以分離放線菌SR-1102 DNA為模板，采用菌落PCR方法進行16S rDNA序列擴增。PCR反應體系（50μL）：ddH2O 34μL，10×buffer 5μL，Mg2+5μL，dNTP 2.5μL，rTaq 0.5μL，Primer各1μL，模板DNA 1μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸90 s，循環33次；72℃總延伸5 min。PCR產物連接克隆載體pEASY-T3并轉化大腸桿菌Top-10中。測序的16S rDNA序列與已登錄Genbank數據庫的基因片段進行blast比對，并利用MEGA 5.0軟件比較同源性和構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 中低溫除硫防腐菌的分離篩選

2.1.1樣品采樣和選擇性富集

油田不同油井采集樣品培養富集培養結果表明，H88-1和H88-31水樣的培養液較空白對照濁度增加。說明培養液中均有明顯的菌體增殖，顯微鏡觀察表明培養基高溫處理培養后富集液中以桿狀為主，培養66 h后部分桿菌產生卵圓形孢子。而未經高溫處理的濃縮液培養后產生大量球菌，66 h后培養基中幾乎沒有桿狀菌體（見表1）。

表1 采集樣品選擇性富集處理篩選菌株的生長狀態

2.1.2除硫防腐菌的分離純化及形態觀察

用涂布法進行分離純化，挑取單菌落涂布于篩選培養基上，獲得純化的1株除硫防腐菌分離菌株，編號為CL-1（圖1）。分離的菌株CL-1在固體培養基形成表面光滑的淡黃色菌落，菌落變異整齊無缺刻，菌落生長速度較快，24 h后菌落直徑3～5 mm，菌體較粗壯，1.8μm×4.1μm～2.5μm×4.5μm，初步鑒定為芽孢桿菌屬（圖2）。

圖1 除硫防腐菌菌株的分離純化

圖2 分離除硫防腐菌菌株的菌體形態

2.2 除硫防腐菌的分子鑒定

2.2.1 CL-1 16S rDNA序列克隆

利用細菌基因組DNA小量試劑盒（AxyPrep）抽提CL-1菌株基因組DNA。設計合成細菌16S rDNA通用引物（27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492R:GCTACCTTGTTACGACTT），以 抽 提CL-1 DNA為模板，對CL-1菌株的16S rDNA序列進行PCR擴增。擴增片段均一，大小在1 500 bp左右。

2.2.2 CL-1 16S rDNA的測序

對目的片段進行割膠回收，連接克隆載體pEASY-T3。轉化大腸桿菌Top-10，篩選陽性克隆進行測序，對結果進行拼接，得到CL-1 16S rDNA序列大小為1 426 bp，測序結果如下：

CL-1：

TGCAAGTCGAGCGAGATTAGAAGCTTGCTTCTGACGTTA GCGGCGGAGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTG GACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCT TCATGGGAGATGATTGAAAGAGTTTCGGCTATCACTTAGATGG GCCCGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGC AACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGG ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTG AGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCGTTAGGGAAGAAC AAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGTAATACGTAGGTGGC AAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGG TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGG GTCAGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAA TTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATGTGGAGGAACACCA GTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGC GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAGGTAGCCACGCCGTA AACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGC TGCAGCTAACGCATTAAGCCCGCCTGGGTACGGTCGCAAGACT GAAACTCAAAGGAATTGACGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT GTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGG GACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTA GTTGCCAGCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAA CCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT GACCTGGGCCACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAA GACCGCGAGGTCAAGCCAATTAAAACCATTCTCAGTTCGGATT GTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAAT CGCGGATCAGCATGCGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACC GCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGA GTAACCGTAAT

2.2.3基于16S rDNA序列同源性的菌株CL-1系統發育樹的構建

將測序結果在NCBI上進行16 S rDNA序列同源性比對。結果顯示，菌株CL-1的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬的巨大芽孢桿菌的16S rDNA序列同源性達100%，據此推測CL-1菌株屬于芽孢桿菌屬（見圖3）。

圖3 基于16S rDNA序列同源性的菌株CL-1與其它相關細菌的系統發育樹

2.3 不同溫度條件對除硫防腐菌生長發育的影響

不同溫度條件試驗結果表明，中低溫除硫防腐菌的生長對溫度具有一定的要求，以25～55℃為宜。在試驗的25～55℃條件下培養24 h，CL-1菌株的孢子都能萌發，孢子萌發數量隨溫度的提高而增加。在40℃條件下培養孢子萌發率最高，平均達232 CFU/皿。隨溫度的提高，孢子萌發率顯著下降，55℃以上孢子幾乎不能萌發（見圖4）。

圖4 不同溫度對CL-1菌株孢子萌發的影響

2.4 除硫防腐菌除硫效果評價

選取Y7-8站泵進口水樣，進行模擬現場環境的室內生物除硫防腐試驗，在40℃條件下投加不同濃度的除硫菌劑CL-1和硫化物抑制劑，考察水樣的腐蝕速率和細菌變化。結果顯示，除硫菌劑可有效除去污水中的硫化物，并且抑制硫酸鹽還原菌的生長，降低污水的腐蝕速率；最優投加濃度為：硫化物抑制劑30 mg/L+0.2%除硫菌劑。

表2 Y7-8站水樣實驗數據

3 結論

（1）通過對JS油田水樣中微生物濃縮富集篩選，分離獲得了1株中低溫除硫防腐菌，最適生長溫度為20～55℃。rDNA鑒定結果表明，CL-1為芽孢桿菌屬的巨大芽孢桿菌。該除硫防腐菌生長旺盛、繁殖速度快，能夠有效去除污水中的硫化物，抑制硫酸鹽還原菌，確定為油田硫酸鹽還原菌競爭抑制菌。

（2）通過中低溫除硫防腐菌的篩選，可配合高溫除硫防腐菌劑開發適用性強、抑制范圍廣的復合除硫防腐菌劑，以適應油田復雜生態系統條件下對硫酸鹽還原菌的抑制，可以有效提高菌劑除硫防腐的能力，對推進生物除硫防腐技術工業化應用具有重要的現實意義。