不同抗氧化劑條件下生物樣品中卡托普利濃度測(cè)定方法的建立及應(yīng)用

趙艷艷 王廷春 李小川 張樞 袁小青 段小群

【摘要】目的在二硫蘇糖醇和抗壞血酸兩種不同抗氧化劑條件下，建立測(cè)定卡托普利血漿濃度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證后將兩種方法分別應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)中，系統(tǒng)的對(duì)比分析兩種抗氧化劑對(duì)卡托普利濃度檢測(cè)的影響，為卡托普利的臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。方法：在不同抗氧化劑條件下考察卡托普利的穩(wěn)定性，添加了抗氧化劑的卡托普利血漿樣本，經(jīng)2，4-二溴苯乙酮衍生化后，乙腈沉淀蛋白處理，ZORBAX SB-C184.6*150mm，3.5μm色譜柱洗脫分離，采用電噴霧離子源多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的正電離法分析檢測(cè)，建立卡托普利LC-MS/MS方法，并在此基礎(chǔ)上分別進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，最后將兩種方法應(yīng)用于卡托普利臨床生物樣本分析中。結(jié)果：卡托普利血漿樣本在10～2000ng/mL（二硫蘇糖醇）和2～1000ng/mL（抗壞血酸）（r均≥0.9994）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，批內(nèi)精密度≤7.4%（n=6），批間精密度≤14.4%（n=18），準(zhǔn)確度為94.7～108.3%，提取回收率為86.6～108.4%（n=6），基質(zhì)效應(yīng)的RSD為1.1%～3.5%（n=6）。穩(wěn)定性（凍融循環(huán)、長(zhǎng)期、短期、冰浴避光）實(shí)驗(yàn)中卡托普利的偏差均小于±15%（n=3）。二硫蘇糖醇和抗壞血酸條件下卡托普利的AUC0～t分別為（3474.8±741.4）、（380.1±108.9）ng﹒h/mL，AUC0～∞分別為（3725.2±798.9）、（389.0±110.1）ng·h/mL ，Tmax分別為（0.94±0.36）、（0.72±0.17）h，Cmax分別為（877.7±182.8）、（319.8±119.7）ng /mL。結(jié)論：0.5%4 mol/L二硫蘇糖醇和0.2%4 mol/L抗壞血酸水溶液均可使卡托普利穩(wěn)定利于檢測(cè)。兩種抗氧化劑條件下卡托普利方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果均符合生物分析要求，兩種檢測(cè)方法都可應(yīng)用于卡托普利臨床樣本分析，但兩種方法的卡托普利藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)有差異性，臨床研究可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

【關(guān)鍵詞】抗氧化劑 ;卡托普利;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

卡托普利是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的特異性競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，廣泛應(yīng)用于高血壓和充血性心力衰竭的治療，它在血漿中消除半衰期相對(duì)較短，口服生物利用度較低（60-75%），與其它高血壓藥物相比副作用較小。卡托普利結(jié)構(gòu)中有個(gè)活性較高的巰基基團(tuán)，在生物基質(zhì)中，硫醇類化合物很容易被氧化成二硫化物或與內(nèi)源性硫醇結(jié)合形成二聚體。由于其活性巰基的存在，很難直接測(cè)定人體血漿中的卡托普利，為卡托普利的生物分析帶來(lái)極大的困擾。

在測(cè)量卡托普利血漿濃度前，需先添加抗氧化劑保護(hù)卡托普利不被氧化，以防止二硫化物的形成。抗壞血酸（Vitamin C， VC）由于其特殊的結(jié)構(gòu)，在各種化學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮抗氧化劑的作用。通過(guò)抗氧化劑自身氧化，使得空氣中的氧與抗氧化劑先結(jié)合，消耗卡托普利內(nèi)部與周圍環(huán)境的氧，從而防止卡托普利被氧化。二硫蘇糖醇（Dithiothreitol， DTT） 是一種常用的巰基保護(hù)劑，通過(guò)硫醇-二硫鍵交換反應(yīng)還原分子內(nèi)或分子間二硫鍵，可以將轉(zhuǎn)化的二硫二聚體（或共軛物）還原為卡托普利。卡托普利本身的靈敏性低和性能差，不適用于生物醫(yī)學(xué)分析，但適當(dāng)?shù)难苌梢酝ㄟ^(guò)LC-MS/MS分析方法進(jìn)行測(cè)量。目前并沒(méi)有任何研究將兩種不同的抗氧化劑進(jìn)行系統(tǒng)的比較并分析這兩種抗氧化劑對(duì)卡托普利臨床樣本檢測(cè)的影響。

本文在VC和DTT兩種抗氧化劑條件下分別建立了測(cè)定人血漿中卡托普利的LC-MS/MS方法，在此基礎(chǔ)上對(duì)這兩種方法進(jìn)行了驗(yàn)證，最后成功應(yīng)用于卡托普利臨床樣本分析。經(jīng)過(guò)不同方法檢測(cè)得出的卡托普利濃度體現(xiàn)了較大的差異性，該數(shù)據(jù)能夠有助于判斷實(shí)際臨床試驗(yàn)過(guò)程中卡托普利抗氧化劑的選擇。

1材料

1.1儀器

液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司，包括DGU-20A3R脫氣機(jī)，LC-20AD液相泵，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO 20S柱溫箱）;三重四極桿串聯(lián)API4000質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源（ESI源）和Analyst 1.6.2數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)AB Sciex公司）;醫(yī)用離心機(jī)（3k15，德國(guó)Sigma公司）;天平（Secura 225D-1CN，德國(guó)Sartorius公司）;渦旋混合儀（Vortex-Genie2，美國(guó)Scientific公司）。1.2藥品與試劑

卡托普利（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100318-201904，純度：99.7%）卡托普利-d3（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：20-JHY-124-3，化學(xué)純度：95%;同位素純度：98.3%）;抗壞血酸（Aladdin，批號(hào)：L1920112，純度：99.99%）;二硫蘇糖醇（Aladdin，批號(hào)：P1378642，，純度：98%）;2，4-二溴苯乙酮（Aladdin，批號(hào)：L1522183，純度：99%）;卡托普利片（美國(guó)Bristol-Myers Squibb公司，規(guī)格25 mg/片）。

2 方法和結(jié)果

2.1不同抗氧化劑前處理方法開(kāi)發(fā)

2.1.1 DTT對(duì)卡托普利生物樣品穩(wěn)定性的影響將4 mol/L的DTT水溶液按照5%的比例加入血漿樣本中，考察卡托普利血漿樣本在冰浴避光0.5 、1 、2 h的穩(wěn)定性，見(jiàn)表1。結(jié)果表明卡托普利血漿樣品中加入0.5%4mol/L DTT水溶液后，卡托普利氧化被抑制，RE在-6.8%～-3.0%之間，其血漿樣品在0.5、1、2h無(wú)明顯變化，穩(wěn)定性較好。

2.1.2DTT對(duì)卡托普利穩(wěn)定性的影響通過(guò)不加DTT放置0.5h、1 h后與再加入DTT經(jīng)前處理后進(jìn)樣對(duì)比分析卡托普利血漿樣本的穩(wěn)定性，見(jiàn)表2。結(jié)果表明卡托普利血漿樣品在室溫避光條件下，降解明顯，在降解后的樣品中加入0.5%4mol/LDTT水溶液后，DTT對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行了還原，使得穩(wěn)定性樣品與即刻樣品的RE在-10.0%～-4.0%之間。

2.1.3VC對(duì)卡托普利生物樣品穩(wěn)定性的影響將3 mol/L、4 mol/L的VC水溶液按照2%的比例加入卡托普利血漿樣本中，經(jīng)前處理后考察卡托普利血漿樣本在1 h、4 h的穩(wěn)定性，見(jiàn)表3。結(jié)果表明在冰浴避光條件下，含0.2%4 mol/LVC水溶液的卡托普利血漿樣品更穩(wěn)定。

2.2溶液的制備

2.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品工作溶液的制備精密稱取卡托普利標(biāo)準(zhǔn)品2份，用甲醇溶液配制成1 mg/ml的卡托普利儲(chǔ)備液，1份用于標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的的配制，1份用于質(zhì)控工作溶液的配制。取卡托普利的儲(chǔ)備液以50%甲醇水進(jìn)行稀釋，獲得卡托普利標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控的工作溶液。精密稱取對(duì)照品卡托普利-d3，用甲醇溶液配制成卡托普利內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液并用乙腈溶液配制成內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.2.2DTT條件下卡托普利標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控血漿樣品的制備取標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控工作液10μL加入190μL的混合空白血漿（含0.5% 4 mol/L的DTT水溶液），混勻配制成卡托普利質(zhì)量濃度分別為10.0、25.0、50.0、100、200、500、1000、2000ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線系列樣品和質(zhì)量濃度分別為10.0 、20.0 、160 、1600ng/mL 的質(zhì)控樣品。

2.2.3 ?VC條件下卡托普利標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控血漿樣品的制備取標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控工作液10μL加入190μL的混合空白血漿（含2%4 mol/L的VC水溶液），混勻配制成卡托普利質(zhì)量濃度分別為2.00、5.00、10.0、50.0、100、200、500 1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列樣品和質(zhì)量濃度分別為2.00、4.00 、300 、800 ng/mL 的質(zhì)控樣品。

2.2.4 ?血漿樣本的處理取200μL血漿樣本加入10μL內(nèi)標(biāo)工作溶液及40μL 2，4-二溴苯乙酮渦旋混勻1min，室溫條件下衍生30min，加入1000μL乙腈，渦旋混勻1min，15400g條件下離心10min，取200μL進(jìn)樣分析。

2.3色譜條件與質(zhì)譜條件

2.3.1 ?色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6*150mm，3.5μm，Agilent）;預(yù)柱：Accucore XL C18（2.1*10mm，4μm，Thermo）;流動(dòng)相：水溶液（含0.1%甲酸和5mmol/L乙酸銨）-乙腈溶液;梯度洗脫（（0.01min～0.20min，30-80%B;0.02min～2.00min，80%B;2.00min～2.01min，80-30%B;2.01min～4.00min，30%B）;流速：1ml/min;柱溫40.0℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4℃;進(jìn)樣體積為2μL。

2.3.2 ?質(zhì)譜條件 帶有ESI源的API4000質(zhì)譜，以正離子模式，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式。噴霧電壓：5.5kV;噴霧器溫度：500℃;霧化氣：50psi;加熱輔助氣：50psi;氣簾氣：20psi;碰撞氣：8psi;掃描時(shí)間：200ms。卡托普利經(jīng)衍生劑2，4-二溴苯乙酮衍生化后含有堿性氮原子，易在ESI源正離子檢測(cè)模式下產(chǎn)生較高響應(yīng)，卡托普利衍生化物定量分析質(zhì)荷比（m/z）414.1→216.0， 卡托普利-d3內(nèi)標(biāo)離子對(duì)衍生化物定量分析質(zhì)荷比（m/z）m/z417.1→219.0。

2.4專屬性考察

2.4.1 DTT條件下卡托普利的專屬性考察六個(gè)不同來(lái)源的單個(gè)空白基質(zhì)未出現(xiàn)顯著干擾，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)互不干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4.2 VC條件下卡托普利的專屬性考察六個(gè)不同來(lái)源的單個(gè)空白基質(zhì)未出現(xiàn)顯著干擾，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)互不干擾，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限

分別取“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析。DTT條件下得到的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.00455x-0.000773（r=0.9999），卡托普利血藥濃度在20～2000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下限為20 ng/mL。VC條件下得到典型標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.00342x+0.000629（r=0.9999）;卡托普利血藥濃度在2～1000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下限為2ng/mL。

2.6 ?準(zhǔn)確度與精密度考察不同條件下卡托普利的準(zhǔn)確度與精密度考察 取“2.2.2”和 “2.2.3”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，測(cè)定3個(gè)分析批，每批每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣品進(jìn)樣分析。考察其批內(nèi)及批間的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

2.7 ?提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察6批不同來(lái)源的空白血漿分別加入VC和DTT兩種抗氧化劑經(jīng)預(yù)處理后得到上清液加入質(zhì)控工作溶液配制成基質(zhì)效應(yīng)樣品，與相同濃度的純?nèi)芤簶悠匪鶞y(cè)得的峰面積比值進(jìn)行比較，考察其基質(zhì)效應(yīng)。提取回收率考察3個(gè)質(zhì)控濃度樣品與空白血漿樣品預(yù)處理后再加入適當(dāng)工作液配的同濃度樣品所測(cè)得的峰面積比值。不同條件下卡托普利的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率分析物提取回收率在86.6%～108.4%之間，基質(zhì)效應(yīng)在93.4%～108.3%之間，CV均≤4.3%;，符合生物樣品分析要求，見(jiàn)表6和表7。

2.8穩(wěn)定性考察 ?不同條件下卡托普利的穩(wěn)定性考察按“2.6.1”項(xiàng)下方法配制低、高質(zhì)量濃度的卡托普利質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行3份，考察血漿樣品中卡托普利在冰浴避光條件下短期、-25 ℃避光放置7天、-80 ℃避光放置28天、60天、5次反復(fù)凍融、處理后樣品自動(dòng)進(jìn)樣器4 ℃放置48 h的穩(wěn)定性，以上條件下穩(wěn)定性均良好，結(jié)果見(jiàn)表8和表9。

2.9藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

受試者給藥前一天晚上禁食不禁水10小時(shí)以上，給藥當(dāng)天空腹口服一片卡托普利片（25 mg），給藥前后lh內(nèi)禁止飲水。給藥前和給藥后15min、30min、45min、l.00 h、l.25h、l.50h、l.75h、 2.00h、 2.50h、3.00h、4.00h、5.00h、6.00h、8.00h、10.00h、12.00h、24.00h共18個(gè)采血點(diǎn)，每個(gè)采血點(diǎn)采4 mL，4000 r/min離心5 min，分離血漿分別置于提前加好不同抗氧化劑的凍存管中，-80 ℃保存，后取血漿樣品按“2.2.4”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，采用Phnenix WinNonlin 7.0軟件以非房室模型計(jì)算臨床受試者體內(nèi)卡托普利的Cmax，AUC0-t，AUC0-∞，Tmax，t1/2，λz，AUC_%Extrap等主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表10，平均藥時(shí)曲線圖見(jiàn)圖3和圖4。

3討論

為了考察兩種不同抗氧化劑對(duì)卡托普利生物樣品檢測(cè)的影響，本研究建立了DTT和VC兩種不同條件下生物樣品中卡托普利的LC-MS/MS分析方法，并對(duì)這兩種方法進(jìn)行了驗(yàn)證，均符合生物分析要求，這兩種分析方法均可用于卡托普利臨床樣本檢測(cè)，通過(guò)不同方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果體現(xiàn)了差異性。

將DTT和VC兩種抗氧化劑條件下的LC-MS/MS分析方法應(yīng)用到臨床樣本檢測(cè)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)DTT條件下卡托普利血藥濃度明顯比VC條件下的卡托普利血藥濃度高，因?yàn)镈TT將卡托普利二硫化物還原為卡托普利，實(shí)際檢測(cè)的濃度為卡托普利和卡托普利二硫化物的總濃度，因此DTT條件下卡托普利血藥濃度偏高。DTT條件下卡托普利達(dá)峰時(shí)間較晚，半衰期較長(zhǎng)。

本研究建立的兩卡托普利檢測(cè)種方法簡(jiǎn)單、易于操作，靈敏度高，得出了不同抗氧化劑條件下卡托普利樣本濃度及藥代動(dòng)力學(xué)的差異性。此項(xiàng)研究為卡托普利臨床研究抗氧化劑的選擇和卡托普利檢測(cè)提供了數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù)。

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