槲皮素對糖尿病大鼠腎臟GSK3β信號通路的影響

王興紅 鄧海峰 孫縵利

（漯河醫學高等專科學校,河南 漯河 462000）

目前，糖尿病腎臟疾病是醫學界研究的熱點。槲皮素因具有廣泛的藥理學作用，現在受到了越來越廣泛的關注。它是一種天然的黃酮類化合物，其優勢是具有多靶點作用和綜合治療優勢的一個中藥單體[1]。王天然等（2013）研究表明，槲皮素對大鼠慢性腎功能衰竭具有一定的防治作用，但是具體的機制尚未完全闡述清楚[2]。倪彩菊等（2021）研究表明，Wnt/β-catenin信號通路廣泛存在于各類生物體內，它是一條相對較保守的信號傳導通路，參與調控細胞的分化、增殖、遷移和凋亡等系列過程[3]。Milanesi等（2019）研究表明，Wnt信號異常激活將導致腫瘤、纖維增生等疾病的發生發展過程，同時也可調控誘導多能干細胞向心肌細胞的分化及增殖，從而起到改善心肌肥厚的作用[4]。本研究從Wnt/β-catenin/GSK3β信號通路入手，研究槲皮素對糖尿病腎臟疾病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物

槲皮素（美國Sigma，純度≥98%），批號 190123；驍悉（上海羅氏制藥有限公司），批號191123。

1.2 動物

成年健康雄性SD大鼠，清潔級，體重300～350 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［SCXK（湘）2016－0003］。全部大鼠常規飼料喂養，自由飲水。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素（STZ）由美國Sigma公司生產，純度＞99%；Wnt3a小鼠抗大鼠單克隆抗體（批號191009）、p-GSK-3β小鼠抗大鼠單克隆抗體（批號190907）、β-catenin小鼠抗大鼠單克隆抗體（批號191003）購自北京博奧森生物公司。

1.4 儀器

三諾SXT-1型快速血糖測定儀（長沙），PowerPac 200電泳儀（美國BIO-RAD公司），Trans-Blot電泳濕轉儀（美國BIO-RAD公司）。

1.5 方法

1.5.1 動物模型的建立與分組

實驗組大鼠一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，以血糖≥16.65 mmol/L為糖尿病大鼠；正常對照組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。實驗組糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組、25 mg/kg槲皮素組和50 mg/kg槲皮素組，槲皮素組臨用前用生理鹽水配成10 g/L的槲皮素溶液每日灌胃治療，正常對照組和糖尿病模型組按體重換算等體積的生理鹽水灌胃處理。

1.5.2 標本采集與處理

第56 d，各組大鼠均心臟采血備用，并立即處死，剖腹取雙側腎臟標本，用濾紙吸干水分，去包膜，稱重，計算腎臟肥大指數（KW/BW，腎臟肥大指數=雙側腎質量/體質量）。

1.5.3 血糖

采用快速血糖測定儀測定各組大鼠血糖。

1.5.4 血BUN、Scr及24h尿蛋白測定

血BUN、Scr用全自動生化分析儀測定；24h尿蛋白的含量采用雙縮脲法測定。

1.5.5 Western blot測定腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin蛋白的表達水平

總蛋白含量采用BCA法測定。蛋白樣品進行10%SDSPAGE電泳，轉移至PVDF膜上，封閉，加入一抗兔抗Wnt3a抗體（1 ∶500）、兔抗p-GSK-3β抗體（1 ∶1 000）和兔抗β-catenin抗體（1 ∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次15 min。洗滌后二抗［羊抗小鼠抗體（1 ∶5 000）］孵育，置于搖床上搖動，室溫下1 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次15 min；ECL發光劑暗室曝光成像、拍照，ImageJ軟件分析求得IOD。

1.6 統計學分析

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），各組均數間的兩兩比較采用LSD－t檢驗。P＜0.05，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般觀察

與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠出現多飲、多尿、多食的癥狀，且毛發色澤黯淡、精神萎靡、活動減少，隨著病程延長，除大鼠體重呈下降趨勢外，其他癥狀更加明顯；與糖尿病模型組比較，槲皮素組治療8周后，上述癥狀和體征均得到較明顯改善。

2.2 槲皮素對糖尿病大鼠血BUN、Scr、24h尿蛋白、腎臟肥大指數的影響

與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠腎臟肥大指數、血BUN、Scr和24h尿蛋白均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與糖尿病模型組比較，槲皮素組大鼠腎臟肥大指數、血BUN、Scr和24h尿蛋白顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠血BUN、Scr、24h尿蛋白、腎臟肥大指數比較（，n=10）

表1 各組大鼠血BUN、Scr、24h尿蛋白、腎臟肥大指數比較（，n=10）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01（下同）。

2.3 槲皮素對糖尿病大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin表達的影響

與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin的表達顯著升高（P＜0.01）；與糖尿病模型組比較，槲皮素組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin的表達顯著降低（P＜0.01），見圖1、表2。

表2 各組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin表達的比較（，n=10）

表2 各組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin表達的比較（，n=10）

圖1 各組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin蛋白表達量（Western blot檢測）

3 討論

糖尿病性腎病（DN）是糖尿病患者最主要的微血管慢性并發癥之一，目前的治療除了進行血液透析，尚無有效的根治措施。因此，采取有效的措施延緩腎功能的下降是有效預防DN的重要措施。

Wang等（2018）研究表明，β-catenin是一種多功能蛋白質，可作為經典Wnt信號通路的第二信使[5]。Li（2017）等研究發現，Wnt3a信號通路不僅調控胰島β細胞的代謝和功能，而且參與糖尿病并發癥的發生、發展，顯示其在糖尿病中具有越來越重要的作用[6]。Kang等（2020）實驗證實白芍總苷對心肌肥厚大鼠的β-catenin蛋白表達有顯著劑量依賴性的抑制作用，提示它可能是通過抑制β-catenin表達發揮抗心肌肥厚作用，推測Baurand實驗結果可能與心臟成纖維細胞適度增殖可防止心力衰竭的發生發展有關，即可能與β-catenin基因敲除組的心臟成纖維細胞適度增殖相關[7]。

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，對冠心病及高血壓患者也有輔助治療作用[8]。課題組前期研究槲皮素可以降低腎組織氧化應激水平和增強抗氧化能力，并減少BUN、Scr、24h蛋白尿，發揮保護糖尿病腎臟的作用[9]。本研究進一步探討了槲皮素對DN的保護作用機制，結果顯示，糖尿病模型組Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin的表達顯著增高，表明上述蛋白參與了糖尿病腎臟疾病的損害過程，這與前人的研究結果是一致的；而經過槲皮素治療8周后，這些參與蛋白均明顯降低，此結果顯示槲皮素能通過抑制Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin蛋白的表達，對腎組織和腎功能有一定的保護作用。

綜上所述，槲皮素對糖尿病大鼠腎功能的保護作用機制與抑制Wnt/β-catenin/GSK3β信號通路密切相關。它能通過抑制Wnt/β-catenin/GSK3β信號通路，避免GSK-3β蛋白的磷酸化，進而使β-catenin保持在一個較低的水平內，從而抑制了腎臟的肥大。