嬰幼兒配方乳粉葉黃素含量檢測不確定度的評定

陳 忱

北大荒完達山乳業股份有限公司質檢中心，黑龍江哈爾濱 150000

0 引言

目前，國家對于嬰幼兒配方乳粉（簡稱“嬰配粉”）的監管日益嚴格[1]，尤其對于葉黃素這類極易降解、添加的營養強化物質含量，抽檢頻次要求更為頻繁[2，3]。對于不同的檢測方法，在其檢測過程中總會引入A類不確定度和B類不確定度，A類不確定度主要來源是測量重復性相對標準不確定度Urel Xrep()和多次測量試樣質量的相對標準不確定度Urel m2()。而B類不確定度則包含的比較廣泛，主要包括工作曲線相對標準不確定度Urel X()，稱量相對標準不確定度Urel m1()，樣品定容體積,的相對標準不確定度Urel V()，標準溶液相對標準不確定度Urel I()等。本文則是針對《GB5009.248—2016 食品安全國家標準 食品中葉黃素的測定》方法，對檢測過程中可能出現不確定的過程進行數學建模[4]，最終獲得嬰配粉中葉黃素含量的不確定度[5]，為檢測數據的準確性提供更加詳實的基礎。

1 原理與方法流程

1.1 方法原理

脂肪含量高（脂肪含量以干基計，不低于3.0%）的食品經氫氧化鉀溶液室溫皂化使葉黃素游離后，再以乙醚-正己烷-環己烷（40∶40∶20，體積比）提取，液相色譜法分離，紫外檢測器或二極管陣列檢測器檢測，外標法定量[6]。樣品在提取與分析過程中，反式結構的葉黃素可能發生異構化，轉化為順式葉黃素。對于轉化產生的順式葉黃素，可通過保留時間定性、峰面積加合定量。

1.2 操作步驟

準確稱取2 g（精確至0.01 g）均勻試樣于50.000 mL聚丙烯離心管中，加入約0.2 g二丁基羥基甲苯（BHT）和10.000 mL乙醇，混勻，加入10.000 mL10.0%氫氧化鉀溶液，渦旋振蕩1 min混勻，室溫避光振蕩皂化30 min，以10.000 mL萃取溶劑避光渦旋振蕩提取3 min，4500 r/min離心3 min，重復提取2 次。合并提取液，以10.000 mL水洗滌，4500 r/min離心3 min分層，重復洗滌1 次，合并有機相于室溫減壓濃縮至近干，以0.1% BHT 乙醇溶液渦旋振蕩溶解殘渣并定容至5.000 mL，過0.45 μm 濾膜，供液相色譜測定。

液態奶：準確稱取10 g（精確至0.01 g）樣品于50.000 mL聚丙烯離心管中，加入約0.2 g BHT和10.000 mL乙醇，混勻，加入2.000 mL20.0%的氫氧化鉀溶液，渦動1 min混勻，室溫避光振蕩皂化30 min，以10.000 mL萃取溶劑避光渦旋振蕩提取3 min，4500 r/min離心3 min，重復提取2 次。合并提取液，以10.000 mL水洗滌，4500 r/min離心3 min分層，重復洗滌1 次，合并有機相于室溫減壓濃縮至近干，以0.1%BHT乙醇溶液渦旋振蕩溶解殘渣并定容至25.000 mL，過0.45 μm 濾膜，供液相色譜測定。在操作過程中，需要注意的是，由于葉黃素對光敏感，除非另行說明，所有試驗操作應在無500 nm以下紫外光的黃色光源或紅色光源環境中進行。

2 數學模型

試樣中葉黃素的含量按下式計算：

式中：X 為試樣中葉黃素的含量，單位為μg/100 g；c為由標準曲線而得的樣液中標準品的含量，單位為μg/mL；V為樣品最終定容體積，單位為mL；m為稱樣量，單位為g；F為校正系數。

可通過以下方式獲得：用液相色譜分析試樣溶液，將順式與反式葉黃素色譜峰面積加合作為總峰面積，其中反式葉黃素峰面積除以總峰面積所得值為校正系數。計算結果保留3 位有效數字。

3 各量值及其不確定度評定

公式1中的各量值見表1。

表1 量值及其不確定度

用液相色譜法測定濃度，為了校準液相色譜儀器，采用葉黃素標準儲備液濃度為20.8575 μg/mL 配制6 種標準溶液，其濃度分別為0.3337 μg/mL、0.6674 μg/mL、1.3349 μg/mL、2.0023 μg/mL、2.6698 μg/mL、3.3372 μg/mL。用液相色譜法對6 種濃度溶液進行含量測定，每個濃度測定3 次，結果見表2。

表2 各濃度下測量葉黃素含量量值

3.1 濃度的不確定度

濃度的不確定度有兩部分構成，一是由于6 種濃度標準溶液擬合的線性方程求得的濃度時測量產生的不確定度；二是由標準儲備液配制成6 種濃度標準溶液時所產生對濃度的測量帶來的不確定度。

3.1.1 濃度的線性方程引起的不確定度

根據表1，數據擬合得到如下線性方程：y=0.7108x+0.0180，其中x為溶液含量，y為峰面積比，對一定濃度的標準溶液進行2 次重復測量，通過線性方程求得待測樣品x=1.6426 μg/mL，則x的標準不確定度為[7]：

式中，n=18（n為標準系列點數6，重復次數3 次）；P 為待測樣品的重復測定次數，P=2；X為待測樣品濃度的平均值1.6426 μg/mL（1.6425 μg/mL，1.6427 μg/mL）；C0為標準系列各點濃度的平均值1.7242 μg/mL）；C0i為各標準液濃度；b為標準曲線斜率0.7108；a為截距0.0180；yi為各標準液的面積比。

根據以上數據，由公式6計算得U（x）=0.0181 μg/mL，標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為：

3.1.2 配標準溶液所產生的不確定度

（1）標準品的稱量引入的不確定度

電子天平準確稱取1.05 mg葉黃素標準品，所使用天平精密度為0.01 mg，包含因子因此，天平的標準不確定度為：

（2）標準品的定容引入的不確定度

配置葉黃素的標準儲備液采用的容量瓶在20 ℃時的體積為50.00 mL，按照《JJG196—2006 常用玻璃量具檢定規程》的要求，經查詢，50.00 mL容量瓶的允差為±0.05 mL，包含因子其標準不確定度Uc（B2）為：

（3）標準溶液稀釋過程溫度對容量瓶引入的不確定度

配制標準儲備液中采用的容量瓶已在 25 ℃時校準，而實驗室的溫度也控制在（20±5）℃。由溫度波動引起的不確定度可通過估算溫度范圍和體積膨脹系數進行計算，液體的膨脹系數遠高于玻璃的膨脹系數，所以玻璃的膨脹系數可忽略。標準工作液是用甲醇配制，甲醇的體積膨脹系數為0.0012 ℃-1，產生的體積變化為：（5010.0012 ℃-1=0.06 mL，則區間半寬度a2=0.06 mL設為均勻分布，包含因子工作液配置過程中用到了6 個10.000 mL容量瓶，（1060.0012 ℃-1=0.072 mL，則區間半寬度a2=0.072 mL設為均勻分布，包含因子k=其標準不確定度Urel（B3）為：

（4）標準溶液稀釋過程移液管引入的不確定度

吸取葉黃素標準儲備液稀釋到標準溶液的過程所用為移液管，吸取不同濃度的標準溶液時所選用的1.000 mL（2 次）、2.000 mL（1 次）、5.000 mL（1 次）、10.000 mL（1 次）的移液管來吸取標準溶液0.0958 μg/mL，0.1915 μg/mL，0.3831 μg/mL，0.7661 μg/mL，1.5323 μg/mL，1.9153 μg/mL。根據 SGCR-3-535 批次胖肚移液管的校正說明書，得到以下規格移液管的偏差范圍，根據均勻分布，包含因子移液管量取體積和次數的不確定度分別見表3、4。

由表3和表4，根據公式可得：

表3 移液管量取體積的不確定度

表4 移液管量取次數的不確定度

3.2 質量的不確定度

質量的不確定度主要有兩個方面，一是所用天平的不確定度，二是多次測量引入的不確定度。天平制造商給出了±0.10 mg 的線性分量，該數值代表了托盤上被稱量的實際重量與從天平所讀取的數值的最大差值。線性分量被假設成矩形分布，換算成標準不確定度為：

上述分量必須計算二次，一次作為空盤，另一次為毛重，因為每一次稱重均為獨立的觀測結果，兩者的線性影響不相關，因此，由天平引起的標準不確定度為：

稱樣量為2.0000 g，則相對不確定度為：Urel（m1）=0.0816/2103=0.0000408

對樣品重復測量10 次引入的不確定度為A類分量，區次測量結果分別為2.0002 g，2.0005 g，2.0009 g，2.0004 g，2.0005 g，2.0003 g，2.0008 g，2.0007 g，2.0007 g，2.0002 g。

3.3 結果的不確定度評定

在重復性條件下，對試樣進行了10 次獨立測試值（μg/100 g）：

標準偏差S=0.675 μg/100g，則算術平均值的不確定度為：

由測量重復性引入的相對不確定度：

3.4 體積的不確定度評定

樣品定容采用在20 ℃時的5.00 mL吸管，按照《JJG 196—2006 常用玻量具檢定規程》的要求，經查詢，5 mL 吸管的允差為±0.025 mL，包含因子 k=其標準不確定度uc（v）為：

4 合成相對標準不確定度評定

合成相對標準不確定度Urel的計算：

5 結論

擴展不確定度評定U c（X）=Urel（X）X=0.012234.3 μg/100g=2.8116 μg/100 g，取置信因子k=2（P約為95.0%）擴展不確定度為U擴展=kUc（X）=5.62 μg/100g，故當多次試驗數據的所測樣品中葉黃素結果為234.30 μg/100g 時，測量結果為：X=（234.30±5.62）μg/100 g。結論在葉黃素含量測定過程中，標準溶液濃度引入的相對不確定度是影響測量乳粉重葉黃素含量不確定度的主要因素[8]。