短枝木麻黃內生真菌Y6液體發酵培養基優化

姚成碩，尚李華，常 歡，李冠軍，李 鍵

（1.福建農林大學林學院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生態系統過程與經營重點實驗室，福建 福州 350002）

植物內生真菌（Endophyte）是指在健康植物組織中具有全部或部分生命周期，不會對宿主植物造成明顯病癥的微生物[1]。迄今為止，許多研究已經證實內生真菌廣泛存在于植物體內[2]。由于內生真菌共生于植物體內，它們的次生代謝產物更容易影響宿主的生理活動，而且許多植物的活性與其內生真菌的次生代謝物活性有相似之處，因此受到了廣泛的關注[3]。早期關于內生真菌的研究多集中在藥用植物[4]，而近年來在生物菌肥的開發利用方面開展了研究工作，取得了比較好的成果：對鹽堿地[5]、干旱礦區[6]等不適宜種植作物的土壤進行改良、增加土壤微生物的數量從而提高土壤有機質含量進而提高作物的產量和品質[7]。現有研究表明，內生真菌可以通過提高植物養分利用效率、產生活性物質或產生對植物有益的信號轉導、改善土壤質量或改變土壤微生物群落等來增強宿主植物抗逆性[8-10]。內生真菌與宿主植物之間的共生關系是長期共同發育形成的，這些內生真菌從宿主植物中吸取所需的營養物質以完成其生命周期，同時，內生真菌在某些植物的生長發育中起重要作用[11]。如甘蔗中分離得到的內生固氮醋桿菌（Acetobacter diazotrophicus）對其宿主植物具有顯著的促生作用[12]，其產生的諸如吲哚乙酸等對植物生長起調節作用的物質能夠加快甘蔗的生長速度以及提高產量[13]。因此，通過植物自身與微生物互作來增強植物的營養生理和抗性機能在森林可持續經營中有廣闊的應用前景。

短枝木麻黃（Casuarina equisetifolia Forst.）屬木麻黃科（Casuarinaceae）木麻黃屬常綠喬木[14]，具有生長快、耐旱、耐鹽堿、防風固沙等功能[15]，是我國東南沿海地區防護林的主要樹種[16]，但長期以來，木麻黃人工林始終面臨衰退現象和林分更新困難，這主要是由于其生環境惡劣有關[17]。現有研究發現,隨著NaCl處理濃度的增加，木麻黃種子的萌發能力、萌發指數和活力指數都呈下降趨勢，發芽幼苗的早期生長也受到抑制，且高鹽濃度抑制作用更明顯，表明高鹽含量明顯抑制木麻黃種子及幼苗的生長，影響了木麻黃的二次更新[18]。如何提高木麻黃幼苗的耐鹽脅迫能力對東南沿海防護林的可持續經營具有重要的現實意義。木麻黃內生真菌具有數量多、多樣性豐富、能夠生產具有生物活性的代謝物質等優點[19]。

課題組前期研究中從短枝木麻黃的小枝分離得到一株耐鹽促生內生真菌，其液體發酵液對寄主植物表現出良好的促生作用[20]，內生真菌的液體培養具有生產周期短、產量高、質量控制容易等優點,有利于規模化生產[21-23]，因此內生真菌菌液培養條件的優化是菌株開發應用的基礎，本研究通過單因子實驗和正交實驗的方法，探究不同因素對其菌絲體液體發酵的影響，以確定最佳培養條件，研究結果可為木麻黃內生真菌液態菌劑的開發累積實驗基礎，也為緩解木麻黃在濱海高鹽分地更新困難問題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌種

短枝木麻黃內生真菌Y6(炭團菌屬Hypoxylon sp.)是福建農林大學森林生態研究所從短枝木麻黃（15 a）小枝中分離得到，現保藏在中國普通微生物菌種保藏與管理中心，保藏號（CGMCC No.18814），前期實驗表明其能提高木麻黃耐鹽性[20]。

1.2 培養基

采用改良馬丁培養基進行菌種活化和接種制備：蛋白胨2.5 g，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g，蒸餾水500 mL，pH值6.2～6.6。將內生真菌在28℃培養7 d，獲得平板菌落，用打孔機將菌落分成若干小部分，取出瓊脂，接種于同體積的馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）50 mL中。將菌株的種子液放入恒溫培養箱在28℃下培養48 h，轉速160 r/min。

1.3 實驗及分析方法

1.3.1 最佳碳源及其濃度篩選

分別將1%蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、葡萄糖和可溶性淀粉作為培養基的唯一碳源，設3個平行實驗[24]，以發酵液的菌絲生物量（OD260）作為衡量指標[25]，通過比較確定最佳碳源。

1.3.2 最佳氮源及其濃度篩選

分別將2%的尿素，NH4Cl，酵母粉，(NH4)2SO4，NH4NO3，蛋白胨作為培養基的唯一氮源，設3個平行實驗[24]，將發酵液菌絲生物量（OD260）作為衡量指標[25]，通過多次比較確定最佳氮源。

1.3.3 最佳裝液量、培養基pH值和接種量篩選

根據前面實驗選擇最佳碳源和氮源添加到培養基中，將裝液量分別設置為20、25、30、35、40、45、50 mL；初始pH值分別調整為pH 5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。接種量分別為1%，3%，5%，7%，10%。每個條件設3個平行[24]，以發酵液菌絲生物量（OD260）為評價指標[25]，確定最佳發酵條件。

1.3.4 最佳發酵條件的選擇

在碳源和氮源的單因素實驗基礎上，進一步選擇可溶性淀粉濃度、NH4Cl濃度、裝液量、培養基pH、接種量作為測試因子，并從單因子實驗結果中選擇3個最佳數據進行正交實驗[26]，確定最佳發酵條件。因接種量為10%時的OD值要明顯高于其他處理，只有1個最佳數據，故不再對接種量進行下一步的正交實驗，最后選擇可溶性淀粉濃度、NH4Cl濃度、裝液量、培養基pH值進行4因素3水平正交實驗（表1）。

表1 培養條件正交實驗設計Tab.1 Orthogonal experimental design of culture conditions

1.3.5 方差分析

通過SPSS 17.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）比較不同處理間的差異[20]。

2 結果與分析

2.1 發酵條件篩選結果

2.1.1 最佳碳源及其濃度篩選

通過單因子實驗進行最適培養條件的篩選，菌株Y6最佳碳源是可溶性淀粉（圖1 a），可溶性淀粉處理下要顯著高于其他組，蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖四組處理沒有顯著差異，葡萄糖處理顯著低于其他組（P＜0.05），故可溶性淀粉最佳，蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖次之，葡萄糖最次；以可溶性淀粉作為唯一碳源，進一步改變其濃度為0.005、0.008、0.015、0.020、0.025 mol/L，不同碳源濃度之間在顯著性水平為0.05或0.01的情況下都未表現出顯著差異，而濃度為0.008、0.015、0.020 mol/L時菌絲生長量要高于其他兩組，故選擇這三組進行下一步的發酵條件優化（圖1 b）。

圖1 碳源種類和碳源濃度對Y6菌菌絲生長量的影響Fig.1 Effects of carbon source type and carbon source concentration on mycelial growth of Y6

2.1.2 最佳氮源及其濃度篩選

最佳氮源是NH4Cl（圖2 a），從圖中可知在該條件下菌絲生長量要明顯高于其他組（P＜0.05）。NH4Cl濃度為0.025 mol/L時菌絲生長量與其他組有顯著差異（P＜0.01），且顯著低于其他組，氮源濃度0.005 mol/L處理與0.008 mol/L處理對菌株生長產生的影響未達到顯著差異（P>0.01），因碳氮源濃度過低時不能為菌株生長提供充足的營養物質，故選擇氮源濃度（0.008、0.015、0.020 mol/L）3組進行接下來的正交實驗（圖2 b）。

圖2 氮源種類和氮源濃度對Y6菌菌絲生長量的影響Fig.2 Effects of nitrogen source type and nitrogen source concentration on mycelial growth of Y6

2.1.3 最佳裝液量、培養基pH值和接種量篩選

裝液量分別為20、25、30、35、40、45、50 mL進行試驗，沒有達到顯著差異（P＞0.05），通過前期單因素實驗確定裝液量的三水平選擇為30、40、50 mL；初始pH值對菌株的生長有明顯的影響，從pH值從5升到7的過程中，生長量增長緩慢，pH值從7到7.5的變化中生長量發生了驟增，當pH值為7.5時生長量達到最高，pH值在7.5～8.5范圍內沒有明顯差異（P＞0.05），可見Y6菌在偏堿性環境（pH值為7.5～8.5）下更適宜生長，中性環境（pH值為7）次之，酸性環境（pH值為5～6.5）生長更差；隨著接種量的增加，生長量逐漸增加，到接種量為10%時達到最大，且顯著高于其他四組處理（P＜0.01），由此可確定其為最佳用量（圖3 a、b、c）。基于前面單因素實驗綜合考慮，按10%接種量為確定值，以碳源濃度（0.008、0.015、0.020 mol/L）、氮源濃度（0.008、0.015、0.020 mol/L）、裝液量（30、40、50 mL）和pH值7、8、9作4因素3水平正交實驗。

圖3 裝液量、pH值和接種量對Y6菌菌絲生長量的影響Fig.3 Effects of liquid medium,pH value and inoculation amount on mycelial growth of Y6

2.2 發酵條件優化

由表2可知，不同營養因素對菌體OD值的影響程度由大到小的順序為培養基pH值＞氮源濃度＞裝液量＞碳源濃度。正交分析得到的最佳水平組合為A2B3C1D2。在此條件下,發酵液D（260）值為0.310，菌絲生物量最高。對該實驗進行方差分析（表3），可知pH值對菌體培養有極顯著影響（P＜0.01），而其他因素對菌體培養影響不顯著(P＞0.05)。

表2 液體培養條件的正交設計結果Tab.2 Orthogonal design results of liquid culture conditions

表3 變量A-D的方差分析結果Tab.3 ANOVA results of variables A-D

3 結論與討論

通過單因子實驗和正交實驗對短枝木麻黃菌株Y6的液體培養基條件進行優化，首先采用了單因子實驗來進行最佳碳源和最佳氮源的篩選，確定可溶性淀粉為最佳碳源，NH4Cl為最佳氮源，最后通過設計四因素三水平的正交實驗來考察碳源濃度、氮源濃度、培養基pH、裝液量對菌體生長的影響進而選擇最佳液體培養條件進行培養基的優化，確定了菌株Y6在可溶性淀粉濃度1.5%，NH4Cl濃度2%，初始pH值8，30 mL裝液量，10%接種量的培養條件下最適宜生長，此時的OD值為0.310。

可溶性淀粉作為碳源有利于菌株Y6的生長，且促進生長的效果比其他碳源更為明顯。在篩選最佳氮源上，發現銨態氮源有利于菌株生長，尤其是NH4Cl，而有機氮源的效果并不好。在優化培養條件方面，發現相比于微酸環境菌株Y6更適合在pH值7.5～8.5的偏堿性環境下生長，說明相對于酸性脅迫而言其對堿性脅迫具有更強的耐受性，根據耐堿性的特點，可將其種植在大面積鹽堿地從而達到改善生態、綠化環境的目的[27]。由于木麻黃長期生長在濱海鹽堿地，為適應環境其結構特征發生了變化，葉片退化故只能通過小枝進行光合作用[28]。植物葉綠體基質的pH值在8.0左右，屬于偏堿性的條件，其中的多種酶必須在適宜的pH環境下才具有最高的活性[29]。本次實驗采用的菌株Y6是從短枝木麻黃小枝分離得到的，菌株Y6適宜在偏堿性環境中生存，以保證植物的生長發育。由于本次實驗所設的pH值水平梯度有限，在強酸強堿環境中菌株的生長情況還有待進一步研究。

單因子實驗和正交實驗是大多數內生真菌液體培養基優化時用來確定最佳培養條件的方法，也有在單因素實驗的基礎上運用其他技術來進行優化的。液體發酵過程中影響因素十分復雜，不同影響因素之間存在著交互作用，僅僅通過單因子實驗和正交實驗往往無法獲得很好的預期結果[30]。而采用響應曲面法就可以既優化影響液體發酵的因子的交互作用，又簡化實驗次數[31]。本實驗欠缺一組未優化前的培養基進行對照，無法得知優化后生長量的提高率。本次研究通過探究菌株Y6最適宜的液體培養條件，為進一步的規模化生產奠定了基礎，但存在著采用的方法較為簡單、劃分的濃度梯度較低等問題，因此如何改善優化方法，提高產量是下一步研究的重點。