青檀內生真菌高抗氧化活性菌株篩選及其培養條件優化

柴新義，李夢宇，于士軍，孫 星，羅 俠，張微微，胡文龍

(1.滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000；2.滁州南譙區大柳鎮鳳勝食用菌生產合作社，安徽 滁州 239000)

1993年，Stierle[1]從短葉紅豆衫中分離出能合成抗癌物質的內生真菌，由此關于內生真菌及其活性物質的研究才真正開展起來。近年來，內生真菌的次生代謝物在病害和蟲害的生物防治中起到很大作用，可在農業中發揮重大作用，使植物的生長免遭病蟲破壞[2-4]。在醫藥方面，可推進抗生素類藥物的研發，治療各種新型疾病。因此，越來越多的學者研究植物內生真菌[5-6]。關于內生真菌代謝產物中活性物質的研究主要應用在醫學方面，如抗癌、抗腫瘤等活性物質藥物的研發[7]。真菌方面在對紫薯、麻黃、三尖杉、枸杞等植物內生真菌次生代謝產物及發酵產物的研究中取得了一定的結果，加速了生物活性物質方面的研究進展[8-10]。近年來，對植物內生真菌的研究主要包括裸子植物和被子植物，研究發現，內生真菌具有活性的菌株可為農業方面及抗性藥物的研發提供參考依據[11-12]。

青檀是我國特有的古老榆科植物，在植物與其內生真菌長期協同進化的過程中，往往已形成了豐富和穩定的內生真菌菌群，從青檀植物內生真菌資源中篩選出高抗氧化活性的菌株具有巨大的潛力。由此，本研究通過對青檀內生真菌高抗氧化活性菌株的篩選和培養條件的優化，以期為今后的深入研究和工業化生產提供重要參考。該研究不僅有利于保護我國稀有的特有野生樹種青檀，而且利于推進抗氧化、抗癌和抗腫瘤等生物藥物的研發。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株分離自安徽瑯琊山內我國特有的野生榆科植物青檀健康的枝條內，共30株，由滁州學院生物與食品工程學院微生物學實驗室提供。

1.1.2 培養基

液體發酵培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨2 g/L，K2HPO43.2 g/L，CuSO46.0×10-3g/L，MgSO40.2 g/L，pH自然。

液體菌種培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO43 g/L，VB11.0×10-2g/L，pH自然。

1.1.3 試劑與設備

二苯代苦味肼基自由基（DPPH），75%乙醇，2%次氯酸鈉，葡萄糖，蔗糖，乳糖，可溶性淀粉，NH4CL2，(NH4)2SO4，蛋白胨，尿素，K2HPO4，CuSO4，KH2PO4，MgSO4，VB1等。

高壓蒸汽滅菌鍋,YXQ-LS-75SII，西安常儀儀器設備有限公司；超凈工作臺，BBS-SDC，濟南飛捷醫療設備有限公司；恒溫培養箱，LHS-80SC(H)，上海印溪儀器儀表有限公司；干燥箱，101-3A，南京實驗儀器廠；恒溫培養振蕩器，DHZ-1112，上海精宏儀器有限公司；電子天平，FA1004，江蘇南京設備儀器商城；超速離心機，IEC Multi，美國熱電集團；紫外分光光度計，752N，上海精科儀電。

1.2 方法

1.2.1 制備菌絲體發酵粗體液

配制3000 mL液體發酵培養基，按每瓶100 mL裝至錐形瓶中，滅菌15 min后在超凈工作臺中用直徑1 cm的打孔器取供試菌株3塊，接種至錐形瓶中，然后放入轉速150 r/min、25℃的恒溫培養振蕩器中培養7 d。隨后，用8層無菌紗布對上述培養物進行過濾，過濾后的液體置轉速5000 r/min的離心機，離心處理20 min，然后用移液槍移取10 mL液體，再用0.45 mm的濾膜過濾，即可獲得粗提液。

1.2.2 粗提液抗氧化活性的測定

制備0.065 mmol/L的DPPH自由基溶液，然后取上述離心后的粗提液2 mL，加入1.9 mL的DPPH自由基溶液，將其置于37℃環境中反應30 min，然后再放入離心機中離心5 min，最后利用紫外分光光度計測定樣品517 nm處的吸光值，設置空白對照記為Amax，樣品溶液吸光值記為A0，樣品加DPPH自由基溶液吸光值記為Ai，用公式DPPH=[1-(Ai-A0)/Amax]×100%，計算自由基的清除率。

1.2.3 制備液體菌種

用馬鈴薯制備液體種子培養基1000 mL。分裝滅菌后，接種具有高抗氧化活性的菌株，放入恒溫培養振蕩器中培養3～4 d，培養物作為發酵培養條件優化研究的液體菌種。

1.2.4 高抗氧化活性菌株培養條件的優化

（1）最適碳源的篩選：以液體發酵基本培養基為基礎，分別選擇乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖為唯一碳源，添加量為20 g/L，接種液體菌種培養基20 mL，放入恒溫培養振蕩器中25℃下，培養7 d，測定DPPH自由基清除率。每個處理3個重復。

（2）最適氮源的篩選：以液體發酵基本培養基為基礎，分別選擇蛋白胨、尿素、NH4Cl2、(NH4)2SO4為唯一氮源，添加量為20 g/L，接種液體菌種培養基20 mL，放入恒溫培養振蕩器中25℃下，培養7 d，測定DPPH自由基清除率。每個處理3個重復。

（3）最適裝液量的確定：在250 mL的錐形瓶中分別裝入80、100、120、140 mL的液體發酵基本培養基，接種液體菌種培養基20 mL，放入恒溫培養振蕩器中25℃下，培養7 d，測定DPPH自由基清除率。每個處理3個重復。

（4）最適pH值的確定：以液體發酵基本培養基為基礎，分別調節起始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0，接種液體菌種培養基20 mL，放入恒溫培養振蕩器中25℃下，培養7 d，測定DPPH自由基清除率。每個處理3個重復。

（5）最適溫度的確定：以液體發酵基本培養基為基礎，接種液體菌種培養基20 mL，放入溫度分別為25、27、29、31℃的恒溫培養振蕩器中，培養7 d，測定DPPH自由基清除率。每個處理3個重復。

（6）最適培養時間的確定：以液體發酵基本培養基為基礎，接種液體菌種培養基20 mL，放入恒溫培養振蕩器中，分別培養6、8、10、12 d，測定DPPH自由基清除率。每個處理3個重復。

1.2.5 數據處理

利用公式DPPH=[1-(Ai-A0)/Amax]×100%計算自由基的清除率。利用SAS 9.12軟件中GLM模塊進行不同處理之間的差異性分析。

2 結果與分析

2.1 青檀內生真菌抗氧化活性菌株的篩選

對供試的30株青檀枝條內生真菌菌株進行DPPH自由基清除率試驗，結果表明：有3株內生真菌表現了較強的抗氧化活性，占供試菌株的10%，菌株CZXY0024的DPPH自由基清除率最高，達（79.35±0.09）%，且與CZXY0014和CZXY0027兩個菌株之間的DPPH自由基清除率存在明顯差異（表1）。因此，選擇菌株CZXY0024進行高抗氧化活性菌株培養條件的優化試驗。

表1 青檀內生真菌菌株對DPPH自由基清除率試驗Tab.1 DPPH radical scavenging activity of endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

2.2 高抗氧化活性菌株培養條件的優化

2.2.1 單因素試驗

（1）最適碳源

實驗結果表明，不同碳源對青檀內生真菌發酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在顯著性差異（圖1）。葡萄糖作為碳源時，DPPH自由基清除率最高，為62.07%。可溶性淀粉作為碳源時，DPPH自由基清除率最低，僅為27.32%。因此，選擇葡萄糖作為最佳培養碳源。

圖1 不同碳源對青檀內生真菌發酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（2）最適氮源

實驗結果表明，不同氮源對青檀內生真菌發酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在顯著性差異（圖2）。硫酸銨作為氮源時，DPPH自由基清除率最高，為67.71%。氯化銨作為氮源時，DPPH自由基清除率最低，僅為37.82%。因此，選擇硫酸銨作為最佳培養氮源。

圖2 不同氮源對青檀內生真菌發酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（3）最適裝液量

實驗結果表明，不同裝液量對青檀內生真菌發酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在明顯差異（圖3）。裝液量100 mL時，DPPH自由基清除率最高，達70.32%。因此，選擇100 mL/250 mL的裝液量作為最佳培養裝液量。

圖3 不同裝液量對青檀內生真菌發酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of different liquid contents on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（4）最適pH值

實驗結果表明，不同起始pH值對青檀內生真菌發酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在明顯差異（圖4）。pH值7.0作為起始pH時，DPPH自由基清除率最高，為56.79%。pH值5.0作為起始pH時，DPPH自由基清除率最低，僅為27.21%。因此，pH值7.0可作為最適起始pH。

圖4 不同起始pH對青檀內生真菌發酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effects of different initial pH on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（5）最適溫度

實驗結果表明，不同發酵培養溫度對青檀內生真菌發酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在明顯差異（圖5）。培養溫度為27℃時，發酵粗體液對DPPH自由基清除率最高，達59.71%。培養溫度為31℃時，DPPH自由基清除率最低，僅為29.78%。因此，選擇27℃的發酵培養溫度作為最適培養溫度。

圖5 不同培養溫度對青檀內生真菌發酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effects of different culture temperature on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（6）最適培養時間

實驗結果表明，不同發酵培養時間對青檀內生真菌發酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在明顯差異（圖6）。培養時間為8 h時，發酵粗體液對DPPH自由基清除率最高，達67.61%。培養時間為6 h時，DPPH自由基清除率最低（43.54%）。因此，選擇8h作為最適發酵培養時間。

圖6 不同培養時間對青檀內生真菌發酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of different culture time on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

2.2.2 正交試驗

在單因素實驗結果的基礎上，選取最適裝液量、pH、培養溫度、培養時間4個因素，每個因素選取3個水平，設計正交試驗(表2)。

表2 正交試驗組合設計表Tab.2 Orthogonal experimental design

正交試驗優化結果表明，影響青檀內生真菌發酵粗提液抗氧化活性的因素大小順序為：起始pH值>培養溫度>培養時間>裝液量。由此可知，起始pH值對青檀內生真菌發酵粗提液的DPPH自由基清除率影響最大，其次為培養溫度和培養時間，裝液量的影響最小。因此，青檀內生真菌高抗氧化活性菌株CZXY0024最優發酵培養條件的組合為：葡萄糖20 g/L、(NH4)2SO42 g/L、K2HPO43.2 g/L、CuSO46×10-3g/L、Mg-SO40.2 g/L、最適裝液量80 mL、pH 7.0、溫度27℃、培養時間8 d，該培養條件下青檀內生真菌發酵粗提液對DPPH自由基清除能力最高，達86.68%（表3）。

表3 不同正交試驗組合對青檀內生真菌發酵粗提液的DPPH自由基清除率的影響Tab.3 Effects of different orthogonal test combinations on DPPH free radical scavenging efficiency of endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

3 討論與結論

劉雅莉等[13]對蒺藜內生真菌分別測定了發酵液對DPPH、OH、O2自由基的清除能力，其在21株內生真菌中發現9株具有氧化活性，占42.86%。高強等[14]發現，采集自山東泰安的青檀葉片中的球毛殼具有較高的抗氧化活性。張新國等[15]對從烏頭、唐松草、車前草等藥用植物中分離出的43株內生真菌進行了抗氧化活性研究，結果發現其中6株具有較好的抗氧化活性，占9.84%，且6株內生真菌對OH自由基具有較強的清除率(>50%)。劉洋等[16]研究發現，5株杜仲葉部內生真菌發酵產物在體外具有較高的清除DPPH自由基能力，同時發現杜仲葉部內生真菌的次級代謝產物對DPPH的清除率具有劑量依賴性。本研究對分離自我國特有榆科植物青檀中的30株內生真菌進行了抗氧化活性的篩選實驗，發現其中3株真菌具有較好的抗氧化活性，占供試菌株的10%。由上可見，植物內生真菌是可以作為篩選抗氧化活性菌種的重要資源之一。

曹正等[17]對四種不同靈芝子實體提取物的抗氧化活性進行了研究，結果顯示DPPH自由基清除率可達81.88%。劉力等[18]利用從自然發酵的酸漿水中分離的2株淀粉乳桿菌和阿米塞畢赤氏酵母進行發酵豆腐黃漿水以研究其清除DPPH自由基的能力，結果顯示在單菌發酵時淀粉乳桿菌發酵黃漿水對DPPH自由基清除能力沒有增強作用，而經過阿米塞畢赤氏酵母發酵的豆腐黃漿水清除DPPH自由基的能力得到一定提高，達38.49μmol/mL。張天博等[19]對一株保加利亞乳桿菌突變菌株UV2-6進行發酵條件的優化研究，結果表明在麥芽糖2%，酵母膏3%，復合無機鹽0.1%，吐溫800.1%，pH值為8.0，接種量3%，42℃培養的條件下，DPPH自由基清除率達81.46%。而本研究中篩選的青檀內生真菌高抗氧化菌株對DPPH自由基清除率可高達86.68%。另外，通過對青檀內生真菌抗氧化活性菌株篩選及其發酵培養條件的研究，有望為今后的生物藥物開發和生產提供參考。

青檀內生真菌菌株CZXY0024的最優生產組合為：葡萄糖20 g/L、(NH4)2SO42 g/L、K2HPO43.2 g/L、CuSO46×10-3g/L、MgSO40.2 g/L、最適裝液量80 mL/250 mL、pH 7.0、溫度27℃、培養時間8 d，該條件下發酵粗提液對DPPH自由基清除能力最高，可達86.68%。