見血清種子形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

李國(guó)平，徐自坤

（1.武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300 ；2.武夷山國(guó)家公園管理局，福建 武夷山 354300 ）

見血清（Liparis nervosa）為蘭科羊耳蒜屬植物，全草具涼血止血、清熱解毒功效，為民間十大止血要藥之一，廣布于全世界熱帶與亞熱帶區(qū)域，在我國(guó)長(zhǎng)江以南各省常見[1-2]。見血清在自然環(huán)境下繁殖率極低，加上人為過度采挖，野生資源破壞日益枯竭，利用種子進(jìn)行無菌播種快繁是見血清保育研究的重要內(nèi)容[3]。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者在見血清植物學(xué)特性、化學(xué)成分及藥理作用等方面進(jìn)行了研究[4-6]，但至今尚未見對(duì)見血清種子形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道。通過對(duì)見血清種子形態(tài)結(jié)構(gòu)、種皮成分及種皮破除處理方法的研究，以期為今后建立大規(guī)模繁殖技術(shù)的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集武夷山地區(qū)野生見血清成熟蒴果，取種子作為研究材料。

1.2 方法

1.2.1 種子形態(tài)大小觀察

取成熟見血清種子制成水裝片置光學(xué)顯微鏡（LeicaDM 2500 German）下觀察并拍照，用顯微測(cè)微尺法測(cè)量種子長(zhǎng)寬以及種胚長(zhǎng)寬（取30 粒種子的平均值）。按蘭科種子體積計(jì)算公式計(jì)算以下參數(shù)[7-8]：

種子體積=2×[(W/2)2×(1/2L)π/3]；

種胚體積=（4/3 ）πab2(W 為種子的寬，L 為種子的長(zhǎng)；a 為1/2 種胚長(zhǎng)，b 為1/2 種胚寬)；

種胚占種子體積=種胚體積/種子體積×100% ；

氣腔體積=(種子體積－ 胚的體積)/種子體積×100%

1.2.2 種子的整體透明染色與觀察

參考李國(guó)平等[9]方法，觀察見血清種子的結(jié)構(gòu)特征，種子經(jīng)FAA 固定、沖洗、1mol 鹽酸水解后用稀釋的愛氏蘇木精染色液進(jìn)行整體染色，經(jīng)脫水后用水楊酸甲酯（冬青油）進(jìn)行透明處理。將透明后種子置于滴有丁香油的載玻片上，用光學(xué)顯微鏡（LeicaDM 2500 German）觀察并拍照。

1.2.3 種皮細(xì)胞壁成分的鑒定

種皮細(xì)胞壁成分的鑒定采用顯微化學(xué)鑒別法[10-11]。以氯化鋅-碘試劑鑒定種皮細(xì)胞壁纖維素成分，以鹽酸—間苯三酚染液鑒定種皮細(xì)胞壁木質(zhì)素成分，以蘇丹Ⅲ酒精飽和溶液鑒定種皮細(xì)胞中角質(zhì)和脂肪成分。

1.2.4 種子預(yù)處理和染色率測(cè)定

取成熟種子分別用濃度為0.5%、1%的氫氧化鈉處理1～8 min，用清水沖洗干凈后，再用醋酸洋紅染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察、統(tǒng)計(jì)染色率。每處理100粒，3次重復(fù)。染色率=（染色數(shù)/種子總數(shù)）×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 見血清種子的形態(tài)與結(jié)構(gòu)

見血清種子細(xì)如粉塵狀，乳白色，呈狹長(zhǎng)紡錘形，中間寬，兩端漸細(xì)；種子長(zhǎng)（1.178±0.028）mm，寬（0.122±0.017）mm，種子體積4.59×10-3mm3；種皮透明、膜質(zhì)，具一層細(xì)胞，多呈長(zhǎng)方形；胚位于種子中央，呈橢圓形，黃綠色，種胚長(zhǎng)（0.189±0.029）mm，寬（0.079±0.011）mm，體積0.617×10-3mm3，種胚占種子體積13.44%；種子氣腔體積占86.56%（圖1a）。

成熟種子經(jīng)整體染色、冬青油透明，可在光學(xué)顯微鏡下清晰顯示種胚結(jié)構(gòu)特征（圖1b）。種子無胚乳，種胚具短柄。胚處于球形胚發(fā)育階段，胚細(xì)胞呈球形，原生質(zhì)濃厚，細(xì)胞核大。種皮為死細(xì)胞，呈透明狀。

圖1 見血清種子的形態(tài)與結(jié)構(gòu)（a）示種子形態(tài)（10×）；（b）示種胚結(jié)構(gòu)（40×）Fig.1 Seeds morphology and structure of Liparis nervosa（a）showing the seed morphology;（b）showing the seed embryo structure

2.2 見血清種皮細(xì)胞壁成分

見血清種子經(jīng)碘—氯化鋅染色法染色以后，種皮細(xì)胞壁染成藍(lán)紫色（圖2a），說明細(xì)胞壁中都含有纖維素；鹽酸-間苯三酚染色反應(yīng)呈桃紅色（圖2b），說明種皮細(xì)胞壁中含有木質(zhì)素成分；蘇丹Ⅲ酒精飽和溶液染色反應(yīng)呈橘黃色（圖2c），說明種皮細(xì)胞壁中含有角質(zhì)成分。因此，見血清種皮細(xì)胞壁中含有纖維素、木質(zhì)素和角質(zhì)。

圖2 見血清種皮細(xì)胞壁成分顯微觀察（a）碘-氯化鋅溶液染色（20×）；（b）鹽酸—間苯三酚溶液染色（40×）；（c）蘇丹Ⅲ酒精飽和溶液染色（40×）Fig.2 The microscopical observation of cell wall components of Liparis nervosa seed coat（a）Staining with iodine-zinc chloride solution;（b）Staining with hydrochloric acid-resorcinol solution;（c）Staining with sudanⅢ-alcohol saturated solution

2.3 種子預(yù)處理對(duì)染色率的影響

用0.5%、1%的氫氧化鈉處理見血清種子后進(jìn)行醋酸洋紅法染色，于顯微鏡下觀察染色程度，結(jié)果如圖3。

圖3 不同濃度氫氧化鈉處理對(duì)見血清種子染色率的影響Fig.3 Effects of different NaOH concentration on seed dyeing rate

用0.5%氫氧化鈉處理1～3 min，觀察不到種子胚著色；處理4 min后，種子胚開始著色，說明種皮開始受到破壞，染色液可以滲入種胚；處理6 min的染色率為（58.8±6.1）%，處理8 min的染色率達(dá)100%。用1%氫氧化鈉處理2 min后，種胚即開始著色，處理4 min染色率可達(dá)100%，延長(zhǎng)處理時(shí)間，種胚著色加深，而且種胚細(xì)胞受到了不同程度的破壞，說明氫氧化鈉濃度對(duì)種胚染色率有顯著影響。1%的氫氧化鈉對(duì)見血清種皮有較強(qiáng)的腐蝕性。建議用0.5%氫氧化鈉處理6 min作為見血清種子無菌播種培養(yǎng)前預(yù)處理的適宜參數(shù)。

3 討論與結(jié)論

見血清的種子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，由種皮和胚兩部分構(gòu)成，無胚乳，且胚發(fā)育不完全，處于球形胚階段，這些特征與其他蘭科植物種子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征相吻合[7,12]。蘭科植物種子在形狀、大小、顏色、體積以及種皮、胚結(jié)構(gòu)及相對(duì)比例等方面表現(xiàn)出多樣性，其中蘭科植物種子氣腔占種子體積的大小具有重要的生態(tài)學(xué)意義[13-14]，氣腔占種子體積的50%以上者為輕浮型種子，反之則為非輕浮型種子[8]。見血清的種子體積僅為4.59×10-3mm3，相對(duì)較小，且氣腔體積占 種子體積的86.56%，屬典型的輕浮型種子，適于長(zhǎng)距離傳播，這與見血清廣布于全世界熱帶與亞熱帶區(qū)域的分布特征相吻合。

蘭科植物種子具休眠特性，種皮的機(jī)械阻力和通透性差一直被認(rèn)為是影響其萌發(fā)的主要因素之一。本研究中觀察到見血清種皮細(xì)胞壁中含有纖維素、木質(zhì)素和角質(zhì)，這些物資在種皮上積累后大大降低了種皮的通透性，阻礙了種子對(duì)水分、氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而導(dǎo)致種子休眠。一些研究也表明，蘭科植物種子發(fā)育后期珠被細(xì)胞開始積聚木質(zhì)素，并最終纖維化和角質(zhì)化[15-17]。

在自然條件下，蘭科植物種子發(fā)芽率很低，只有感染了合適的真菌后才能萌發(fā)生長(zhǎng)，真菌的作用一是破壞種皮，增加透水透氣性，二是為胚胎細(xì)胞的發(fā)育通過營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在蘭科植物無菌播種與組織培養(yǎng)研究中，常用NaOH等化學(xué)試劑預(yù)處理以破壞種皮，促進(jìn)種子萌發(fā)[18-19]。本研究實(shí)驗(yàn)表明，0.5%NaOH溶液一定時(shí)間可破壞見血清種皮促進(jìn)種胚著色，推薦0.5%NaOH溶液處理6 min作為見血清種子無菌播種培養(yǎng)前預(yù)處理的適宜參數(shù)。一些研究者曾通過各種方法去除蘭科植物種皮對(duì)種子萌發(fā)的限制，結(jié)果表明預(yù)處理可以提高種子的萌發(fā)率[18-21]。本研究應(yīng)用一定濃度NaOH溶液處理結(jié)合醋酸洋紅染色的方法，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯，可很容易篩選得到適宜的化學(xué)預(yù)處理?xiàng)l件。該預(yù)處理初篩辦法可為其它蘭科植物種子非共生萌發(fā)研究提供參考。