上皮細胞轉化序列2在甲狀腺乳頭狀癌中的表達研究

權明明 陳珍珍 王毅超

甲狀腺癌是內分泌系統常見的惡性腫瘤之一，它常見的病理類型有4種，分別為乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌、未分化癌，其中甲狀腺乳頭狀癌是最常見的病理類型[1]。雖然甲狀腺乳頭狀癌是預后良好的惡性腫瘤，但臨床上仍有部分甲狀腺乳頭狀癌患者預后欠佳[2]。上皮細胞轉化序列2（epithelial cell transforming 2,ECT2）基因是上皮細胞轉化序列基因的一種，已經證實其是一種原癌基因，在多種惡性腫瘤組織中高表達[3-4]。臨床上對于ECT2基因在甲狀腺癌中的表達研究報道不多?；诖?，本研究分析ECT2在甲狀腺乳頭狀癌的表達情況，以期為甲狀腺乳頭狀癌早期診斷提供分子生物學依據，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 甲狀腺乳頭狀癌組織及結節性甲狀腺腫組織均取自2020年5至12月于臺州市中心醫院手術切除的標本，且所有標本獲取均經患者知情同意，患者術前均未行化療、放療、內分泌治療，病理結果均經2位病理科醫生判讀。甲狀腺乳頭狀癌組織標本35例，患者男 5 例，女 30 例，年齡 32～57（44.5±1.92）歲；結節性甲狀腺腫組織標本32例，患者男7例，女25例，年齡31～67（48.7±1.37）歲。兩種組織標本患者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。術后所有標本一半立即存入-80℃冰箱，一半立即置于甲醛溶液中固定，取材體積均約5 mm×5 mm×5 mm。本研究經醫院醫學倫理委員會批準（批件號：2021L02-16）。

1.1.2 主要試劑和儀器 ECT2基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，Trizol RNA提取試劑購自美國Invitrogen 公司（批號：15596026）；Real Maste rMix（SYBR Green）試劑盒購自日本 TakaRa公司（批號：RR066A）；ECT2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司（批號：1627591），DAB顯色試劑盒購自美國BD公司（批號：550880），PCR 儀為美國 ABI公司產品（型號：Stepone），垂直電泳槽及轉膜槽為北京六一儀器廠產品。

1.2 方法

1.2.1 ECT2 mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。設計ECT2基因引物，取存于-80℃冰箱中的甲狀腺乳頭狀癌組織及結節性甲狀腺腫組織，剪碎，每例標本重約 80 mg，采用 Trizol提取細胞中總RNA，用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280=1.8～2.0，并在1%瓊脂糖凝膠電泳中顯示出清晰的28 S和18 S兩條rRNA帶，證明提取的RNA完整。cDNA合成反應體系：取 2 g RNA ，加 2 μl×RT mix（終濃度為 1×），2 μl dNTP混合液（終濃度為 0.25 mmol/L/dNTP），2 μl Oligo-dT15（終濃度為 1 μmol/L），1 μl逆轉錄酶，加 RNase Free ddH2O 至終體積20 μl，于 37℃孵育 60 min。采用SYBR Green熒光染料，參照試劑盒說明完成RT-PCR，反應條件為：預變性95℃ 1.5 min，95℃ 15 s、65℃30 s、68 ℃ 30 s 40個循環；最后 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95℃15 s收集熒光信號，進行熔解曲線分析，以結節性甲狀腺腫組織為參照，反應結束由系統自動計算相對定量結果。

1.2.2 ECT2蛋白表達定性檢測 采用免疫組化法。分別取甲醛溶液浸泡的甲狀腺乳頭狀癌組織及結節性甲狀腺腫組織，置于恒溫烤箱中60℃烘烤20 min，將組織玻片依次放入二甲苯溶液浸泡15 min脫蠟，再經不同梯度乙醇（100%乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇）和ddH2O各5 min水化。將合適的抗原修復緩沖液（枸櫞酸鈉緩沖液pH 6.0）加入高壓鍋內煮沸，將組織切片置于抗原修復沸水緩沖液中進行高壓修復抗原，電爐加熱10 min后去除熱源，打開高壓鍋鍋蓋，利用涼水冷卻10 min，冷卻完成后PBS洗滌2遍，各5 min。因組織切片中可能含有大量的具有活性的過氧化物酶，本研究選擇滴加3%的雙氧水室溫靜置10 min以去除內源性過氧化物酶，以防對組織結構和細胞形態產生不良影響，反應結束后PBS洗滌2次各5 min。取出并擦干組織切片，滴加10%的山羊血清封閉液在玻片上，室溫封閉0.5～1 h，以減少非特異性結合造成的染色。結束后PBS洗滌2遍，各5 min。一抗孵育：取出玻片并擦去多余液體，滴加實驗所需的ECT2抗體（1∶200），置于濕盒中4℃冰箱孵育過夜。第2天取用前需先甩干，并用PBS充分洗滌3次，每次5 min。二抗孵育：洗凈后每片滴加50 μl辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體，在室溫孵育30～60 min，PBS洗滌，每次5 min，重復共3次。DAB顯色：滴加現配的DAB顯色劑，于顯微鏡下掌握染色程度，可用自來水沖洗終止反應。復染：蘇木精復染1～2 min，并用PBS洗凈。脫水透明：依次放入不同梯度乙醇各5 min脫水，最后放置于二甲苯溶液各5 min進行透明處理。封片：用滴管吸取中性樹膠進行封片操作，待玻片樹膠凝固后，顯微鏡觀察結果并拍照分析目的蛋白表達情況。免疫組化結果判斷標準：以陽性細胞所占視野內細胞總數的百分比和細胞著色強度進行計分，根據陽性細胞所占百分比按＜5%、5%～＜25%、25%～＜50%、50%～＜75%和≥75%依次計分為 0、1、2、3和 4分，所記得分≤1分為陰性表達，≥2分為陽性表達。

1.2.3 ECT2蛋白表達定量檢測 采用Western blot法。分別取-80℃冰箱中的甲狀腺乳頭狀癌組織及結節性甲狀腺腫組織，每例約80 mg，加入組織蛋白提取液，冰上研磨，蛋白提取按試劑說明書進行，吸取上清液。每例標本取20 μl用BCA法測蛋白濃度，根據蛋白質曲線計算電泳所需蛋白，配置10%濃縮膠和5%的分離膠，上樣量每孔為 50 μg，標準蛋白 Marker為 5 μl，80～120 V電泳，恒壓10 V 1 h轉膜至硝基纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗2 ml（ECT2抗體濃度1∶1 000）4℃冰箱過夜，加入二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體，濃度為1∶5 000）室溫靜置 1.5 h，ECL發光液滴加。暗室曝光顯影定影，計算機軟件分析蛋白表達水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件，每個實驗至少進行3次重復實驗。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌組織與結節性甲狀腺腫組織ECT2 mRNA表達水平比較 相對于結節性甲狀腺腫組織，ECT2 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達水平為2.4327±0.0127，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。即甲狀腺乳頭狀癌組織ECT2 mRNA表達上調。

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織與結節性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達陽性率比較 甲狀腺乳頭狀癌組織與結節性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達情況見圖1（插頁）。甲狀腺乳頭狀癌組織與結節性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達陽性率分別為 57.1%（20/35）、6.3%（2/32），甲狀腺乳頭狀癌組織表達陽性率明顯高于結節性甲狀腺腫組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 甲狀腺乳頭狀癌組織與結節性甲狀腺腫組織上皮細胞轉化序列2（ECT2）蛋白表達定性觀察（免疫組化染色，×40）

2.3 甲狀腺乳頭狀癌組織與結節性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達水平比較 甲狀腺乳頭狀癌組織與結節性甲狀腺腫組織ECT2蛋白表達水平分別為1.6542±0.0159、0.4826±0.0513，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。即相對于結節性甲狀腺腫組織，甲狀腺乳頭狀癌組織ECT2蛋白表達水平上調，見圖2。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌組織與結節性甲狀腺腫組織上皮細胞轉化序列2（ECT2）蛋白表達電泳圖比較（1、2：甲狀腺乳頭狀癌組織；3、5：結節性甲狀腺腫組織；4：內參蛋白）

3 討論

近年來，甲狀腺癌發病率逐年提高，尤其是甲狀腺乳頭狀癌發病率日益增高，甲狀腺癌發病率約占惡性腫瘤發病率的1%，發達國家高于發展中國家[5-7]。甲狀腺乳頭狀癌發病機制尚不明確，可能與癌基因突變、碘劑量、電離輻射、遺傳等因素有關，并且甲狀腺乳頭狀癌的發病與多個基因相關。

ECT2基因是一種鳥苷酸交換因子，研究證實其與多種惡性腫瘤發病相關，在人類染色體定位于3q26，進化上高度保守，已經被確定為原癌基因。ECT基因N端有兩個同源結構域XCCR1和Clb6，在細胞周期調控及免疫應答上發揮作用，通過對細胞周期的調控，可以動態控制腫瘤的生長[8-11]。ECT2基因在惡性腫瘤發展中起重要作用，在一項對肺癌的研究中，高表達的ECT2與肺癌轉移的晚期和更深的腫瘤侵襲相關[10]。此外，ECT2高表達的肺癌患者總生存期明顯短于ECT2低表達的肺癌患者，Cox回歸分析顯示，ECT2表達是總生存期的獨立預后指標[12]。在胃癌中也有類似的發現，ECT2在胃癌中表達量明顯高于對照組，高表達ECT2的胃癌，其增殖能力及侵襲能力也逐步增強，并且這種上調與腫瘤的上皮間質轉化相關[9]。在胰腺癌組織中，與對照組相比ECT2蛋白同樣高表達，ECT2的表達量與胰腺癌的惡性程度、病例分期密切相關，數據分析表明ECT2基因是胰腺癌的獨立預后因子[13]。在一項關于乳腺癌的研究中發現采用免疫組化、細胞遷移、異種移植方法檢測ECT2在乳腺癌中的表達情況，ECT2在物理上與泛素特異性蛋白酶USP7相互作用，并在功能上促進USP7分子間自結合，支持將ECT2/USP7作為乳腺癌干預的潛在靶點[14]。而在另外一項研究中，采用構建慢病毒ECT2過表達和干擾質粒用于體外檢測。采用CCK-8等方法評價ECT2表達對三陰性乳腺癌細胞系的影響，ECT2是乳腺癌細胞生長的主要驅動因子，在調節三陰性乳腺癌生長中起著重要作用。PTX治療在沉默ECT2后顯著改善療效。這一發現提示，抑制ECT2的表達可促進乳腺癌治療的新方案，并為開發新的靶向藥物替代紫杉醇治療乳腺癌提供理論依據[15]。同樣一項關于乳腺癌的研究中證實ECT2是乳腺癌不良預后的因子[16-17]。關于一項肝細胞癌的研究中，ECT2高表達被發現是肝細胞肝癌的獨立預后危險因素，發現ECT2過表達增加了肝癌細胞的遷移和增殖，ECT2可能通過增強有氧糖酵解和抑制免疫細胞功能來促進M2巨噬細胞的極化。ECT2可作為肝細胞肝癌的候選診斷和預后生物標志物[18]。

本研究結果表明ECT2在甲狀腺乳頭狀癌組織及結節性甲狀腺腫組織均表達，結果采用相對定量方法計算，ECT2基因在甲狀腺乳頭狀癌組織相對于結節性甲狀腺腫組織的表達量為2.4327±0.0127，差異有統計學意義。免疫組化法檢測結果顯示，在甲狀腺乳頭狀癌組織表達陽性率明顯高于結節性甲狀腺腫組織。這結果提示，ECT2在甲狀腺乳頭狀癌高表達，其在甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展中起癌基因作用。關于ECT2基因研究，已經證實在多種惡性腫瘤中高表達，其具體高表達的機制尚無法解釋。有研究表明ECT2基因在腦膠質瘤中是通過泛素化發揮作用[19]，而ECT2基因作為癌基因在甲狀腺乳頭狀癌中如何發揮作用，是否與泛素化有關，值得進一步研究。也有研究證實ECT2基因在雌激素受體陽性乳腺癌及非小細胞肺癌中均是預后不良的獨立因子[20-21]。筆者團隊擬下一步在細胞水平、動物水平進一步使用siRNA進行調控，以期進一步研究ECT2基因發揮癌基因的機制，為甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷、早期干預抑或腫瘤標志物提供客觀的分子生物學依據。