不同分子質量海蚌肝素結構表征及抗凝血與纖溶活性的研究

陳觀蘭,陳菁,陳建平,李瑞,賈學靜,劉曉菲,宋兵兵,鐘賽意,2*

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋生物制品工程實驗室,廣東省海洋食品 工程技術研究中心,廣東 湛江,524008) 2(大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,遼寧 大連,116034)

肝素屬于糖胺聚糖家族,是一種硫酸多糖。各種分子質量肝素作為主要的抗凝藥物應用于抗血栓基本的治療。目前的肝素主要來源于豬、牛等陸地動物,但存在瘋牛病事件、雜質污染事件及宗教信仰等問題，以及出血、骨質疏松癥、血小板減少癥等副作用，因此尋找陸地動物源肝素替代物質變得迫切[1]。與傳統肝素相比,海洋生物硫酸多糖來源相對清潔,而且具有作用途徑多樣、副作用較小的抗血栓活性,是替代傳統肝素的潛力來源[2-5]。

海蚌學名“西施舌”(Coelomactraantiquata),隸屬于軟體動物門的瓣鰓綱,真瓣鰓目,蛤蜊科,腔蛤蜊屬,在我國山東至廣東沿海等地均有分布。海蚌不僅具有較高的營養價值,也具有一定的保健價值。研究表明,海蚌具有抗氧化、降血脂[6]、降血糖[7]、抗腫瘤[8-9]、溶菌[10]活性。此外,本課題組前期通過酶解提取,大孔陰離子交換樹脂純化得到了一種具有高硫酸基含量、良好纖溶活性、強抗凝活性的大分子質量肝素G2[11]。但大分子質量肝素具有黏度大、溶解性差,生物利用度低等缺點[12],且肝素的抗血栓活性與分子質量有關,低分子質量肝素相比普通分子質量肝素,其抗血栓活性具有作用多途徑、多靶點、副作用少等特點[2]。因此,本文對海蚌肝素G2及其降解產物DG1、DG2進行結構表征,并研究其抗凝血、纖溶活性,以期為拓寬肝素的海洋生物來源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蚌,廣東省湛江市水產品批發市場；2709堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、PBS磷酸鹽粉劑、瓊脂糖、綿羊血漿,上海源葉生物科技有限公司；Amberlite FPA98Cl型離子交換樹脂、Na2SO4,上海麥克林生化科技有限公司；肝素(Mw：3.5 k、5 k、8 k、15 k、30 kDa),北京阿斯雷爾生物技術有限公司；肝素標準品(heparin,HP,190 IU/mg)、低分子質量肝素標準品(low molecular weight heparin,LMWH),抗Ⅱa、Ⅹa因子效價分別為571 IU/安瓿、1 497 IU/安瓿、凝血酶(1 000 U)、尿激酶(50 U/mg)、牛纖維蛋白原,中國食品藥品檢定研究所；部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time,PT)和血漿凝血酶時間(thrombin time,TT)試劑盒,武漢中太生物技術有限公司；甲醇(色譜純),賽默飛世爾科技公司；無水乙醇、NaCl等其他試劑,西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-8數顯恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司；Sorvall Lynx6000高速落地離心機,賽默飛世爾科技公司；N-4000旋轉蒸發儀,東京理化器械株式會社；FD8508型真空冷凍干燥機,韓國ilShin公司；Agilent1200高效液相色譜儀,美國安捷倫公司；Bruker Tensor-27傅里葉紅外光譜儀、Bruker Dimension Edge原子力顯微鏡,德國Bruker公司；Varioskan Flash多功能酶標儀器；Chirascan圓二色光譜儀,英國應用光物理公司；JEM-7610-F掃描電子顯微鏡,日本JEOL公司；XN06半自動凝血分析儀,武漢景川診斷技術股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同分子質量海蚌肝素的制備

參考文獻[11]并略作修改，將海蚌去殼，勻漿。料液比1∶10(g∶mL)，6 mg/mL的NaCl溶液，5.4 mg/mL的木瓜蛋白酶和5.4 mg/mL的2709堿性蛋白酶(pH 8.0，50 ℃)，酶解20 h，沸水浴滅酶10 min，冷卻后離心(8 000 r/min，30 min)，取上清液濃縮得海蚌肝素酶解液；以FPA98 CI大孔離子交換樹脂層析柱(26 cm×100 cm)對海蚌肝素進行分離純化，動態吸附上樣后，用0、0.5、1、1.5 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，收集1.5 mol/L的NaCl溶液的洗脫液，每管均收集10 mL，以阿利新藍比色法檢測肝素含量，以收集管數為橫坐標，吸光度值(A490 nm)為縱坐標繪洗脫曲線。根據峰型收集洗脫液，濃縮后加入0.4倍體積的無水乙醇醇沉，透析(3 kDa)、凍干后得海蚌肝素G2。

采用H2O2-維生素C降解法降解G2獲得DG1、DG2。DG1降解劑為4 mmol/L H2O2和5 mmol/L 維生素C,DG2降解劑為64 mmol/L H2O2和5 mmol/L 維生素C,樣品濃度均為5 mg/mL。

1.3.2 不同分子質量海蚌肝素的分子質量測定

通過高效凝膠色譜法測定樣品分子質量。用流動相把海蚌肝素樣品和肝素分子質量窄標(平均分子質量分別為3.55 k、5.2 k、7.4 k、15 k、30 kDa)配制成為5 mg/mL的溶液,用0.22 μm的濾膜過濾后待用。采用Waters Ultra hydrogel TM500色譜柱(10 μm,7.8 mm×300 mm),在流動相為0.2 mol/L Na2SO4溶液,流速0.5 mL/min,柱溫35 ℃,進樣量10 μL的條件下以1200示差折光檢測器檢測肝素分子質量窄標和海蚌肝素樣品的高效凝膠色譜法圖,記錄保留時間后進行數據處理。

1.3.3 不同分子質量海蚌肝素的結構分析

1.3.3.1 傅里葉紅外光譜分析

將海蚌肝素樣品與KBr(質量比1∶100)混勻,研磨后壓制成半透明薄片,采用傅里葉紅外光譜在4 000～400 cm-1處進行掃描。

1.3.3.2 圓二色譜分析

將海蚌肝素樣品配制成0.5 mg/mL的溶液。在25 ℃條件下,以圓二色譜儀在190～240 nm波長范圍進行掃描。

1.3.3.3 掃描電鏡分析

將適量海蚌肝素樣品置于銅片上,粘貼固定,鍍金,在30 kV條件下對海蚌肝素的表面形態進行觀察并拍照。

1.3.3.4 原子力顯微鏡分析

海蚌肝素樣品溶液(10 μg/mL)以0.45 μm一次性濾器過濾,取5～10 μL滴在云母片表面上,室溫下干燥過夜后以原子力顯微鏡觀測其微觀形貌。

1.3.4 不同分子質量海蚌肝素的抗凝血與纖溶活性分析

1.3.4.1 抗凝效價測定

按照中國藥典中肝素鈉效價的測定方法進行測定[13]。

1.3.4.2 體外抗凝血活性評價

采用APTT、PT、TT試劑盒分析海蚌肝素樣品的體外抗凝血活性。所用血漿購自試劑公司的新鮮羊血漿。陰性對照為生理鹽水,陽性對照為肝素鈉標準品。

1.3.4.3 纖溶活性評價

海蚌肝素的體外纖維蛋白溶解活性通過瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定[11]。

1.4 統計學處理

2 結果與分析

2.1 不同分子質量海蚌肝素分子質量測定結果

采用H2O2-維生素C降解法制備不同分子質量海蚌肝素。H2O2作為強氧化劑,可以產生大量的強氧化性的自由基,它可以破壞糖苷鍵,降解多糖[14]。由圖1可知,隨著H2O2濃度增大,降解產物分子質量先急速下降后緩慢下降。當H2O2濃度達到16 mmol/L時,H2O2濃度的增加對降解產物的分子質量影響不明顯。這是因為過量的H2O2可能會被各種機制消耗并破壞剛剛形成的OH·[15]。因此,為了得到不同分子質量的海蚌肝素,本實驗以G2為原料,通過控制H2O2濃度獲得DG1、DG2。通過高效凝膠色譜對G2、DG1、DG2的分子質量進行分析。結果如圖2所示,G2、DG1、DG2的色譜峰單一,且峰形隨著分子質量的降低變得狹窄,說明不同分子質量海蚌肝素純度均較高,降解使海蚌肝素質量分布更為均一。肝素標準品分子質量的對數(y)與保留時間(x)的線性方程為：y=-0.306 6x+9.970 1(R2=0.997 6),以此計算出G2、DG1、DG2的分子質量分別為60.25 k、24.48 k、6.75 kDa。

圖1 H2O2濃度對降解產物分子質量的影響Fig.1 Effect of H2O2concentration on molecular weight of degraded products

圖2 不同分子質量海蚌肝素的高效凝膠色譜圖Fig.2 HPGPC chromatogram of clam heparin with different molecular weights

2.2 不同分子質量海蚌肝素的結構分析

2.2.1 紅外色譜分析

對G2、DG1、DG2進行紅外光譜掃描,結果如圖3所示,890、940 cm-1左右出現了肝素的特征峰,1 240 cm-1左右呈現O—S鍵伸縮振動峰,800～850 cm-1處呈現了氨基己糖上硫酸基團的C—O—S系統伸縮振動峰[1,16]。G2、DG1、DG2的紅外色譜圖基本相似,特征吸收峰和重要官能團種類未發生變化,但隨著分子質量的降低,光譜峰峰值增加,說明G2、DG1、DG2在官能團上無明顯差異,符合肝素的紅外色譜特征,且H2O2-維生素C降解法降解海蚌肝素的過程對基本結構和活性基團沒有影響,可能只是糖苷鍵斷裂,暴露取代基,降低分子質量的過程,而使相應紅外吸收信號增強[17-19]。

圖3 不同分子質量海蚌肝素的紅外光譜圖Fig.3 Fourier transform infrared spectrogram of clam heparin with different molecular weights

2.2.2 圓二色譜分析

圓二色譜是研究化合物三維結構的有效方法。G2、DG1、DG2及HP、LMWH在190～260 nm處的圓二色譜如圖4所示。它們峰值均出現在210 nm左右,但峰值不同。商品肝素與海蚌肝素的色譜峰均隨著分子質量的降低,峰值變小。這些結果表明,降解可能在一定程度上影響肝素的結構[20]。

a-HP和LMWH；b-不同分子質量海蚌肝素圖4 HP、LMWH及不同分子質量海蚌肝素的圓二色譜圖Fig.4 CD chromatogram of HP,LMWH and clam heparin with different molecular weights

2.2.3 掃描電鏡分析

對3種分子質量的海蚌肝素分別進行掃描電鏡觀察,結果如圖5所示。在1 000、3 000、10 000倍鏡下進行觀察,發現海蚌肝素G2呈表面粗糙、多孔的片狀結構。而DG1、DG2在1 000倍下進行觀察,發現隨著分子質量的降低,碎片狀結構和球狀結構增加。這可能與降解后分子質量降低[21-22]或海蚌肝素的分子極性變化有關[23]。

a-G2(×1 000)；b-G2(×3 000)；c-G2(×10 000)； e-DG1(×1 000)；f-DG2(×1 000)圖5 不同分子質量海蚌肝素的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscope graphs of clam heparin with different molecular weights

2.2.4 原子力顯微鏡分析

圖6顯示了在原子力顯微鏡下不同分子質量海蚌肝素的分子形態。在平面圖像中G2呈現網鏈狀結構,每個環狀結構的側鏈情況均清晰可見；DG1呈分散的鏈狀結構；DG2呈現顆粒狀結構,降解前后海蚌肝素的分子形態有很明顯的變化。原子力顯微鏡分析結果和掃描電鏡分析結果是一致的。

a-G2；b-DG1；c-DG2圖6 不同分子質量海蚌肝素的原子力顯微鏡圖Fig.6 Atomic force microscope graphs of clam heparin with different molecular weights

2.3 不同分子質量海蚌肝素的抗凝血與纖溶活性分析

2.3.1 抗凝效價測定結果

肝素的抗凝血活性與它的分子質量和活性五糖序列有關。HP、LMWH均具有活性五糖序列,HP可抑制凝血因子Xa、Ⅱa活性而起抗凝活性,而LMWH僅能作用于Xa。肝素分子質量越大,抗Ⅱa效價越高,而抗Xa效價越低。此外,當肝素的活性五糖序列受到破壞,其抗凝活性將明顯降低[2]。有研究表明肝素抗Xa/IIa值越大,其抗血栓活性越強[1]。因此,抗Xa效價、抗IIa效價和它們的比值常用來比較不同分子質量肝素的抗凝活性。不同分子質量海蚌肝素抗凝血效價如表1所示,海蚌肝素的抗IIa效價隨著分子質量的降低而降低,而抗Xa效價隨著分子質量的降低先上升后降低,DG1抗Xa效價比G2高,DG2比DG1、G2都低。于DG2而言,分子質量的降低并沒有提高它的抗Xa效價,這可能是因為降解程度過大破壞了肝素的活性五糖結構域。此外,在抗Xa/IIa比值上,DG2

表1 不同分子質量海蚌肝素抗凝血效價分析Table 1 Anticoagulant titer analysis of mussel heparin with different molecular weights

2.3.2 抗凝血活性

研究者們經常通過測定APTT、PT、TT來研究樣品的抗凝活性及其作用途徑。APTT、PT、TT分別反映內源凝血途徑、外源凝血途徑和共同凝血途徑的凝血情況。由圖7可知,在試驗濃度范圍內G2和DG1的APTT、TT、PT均與生理鹽水有顯著差異,具有劑量依賴效應,且相近；而DG2的APTT、TT、PT相對于G2、DG1明顯降低,且在低濃度時與生理鹽水無顯著差異；與肝素標準品相比,即使質量濃度達到10 μg/mL時,G2、DG1、DG2抗凝活性依舊明顯弱于肝素。

通過結果來看,推斷G2與DG1的抗凝血活性接近且均能通過內源、外源和共同凝血途徑發揮抗凝血活性,而DG2的抗凝活性與G2相比較低。這可能是因為DG1的分子質量接近于普通分子質量肝素,DG2的分子質量接近于低分子質量肝素。此外不同分子質量的海蚌肝素的抗凝血活性都較為緩和,可能具有較低的出血副作用。

a-PT；b-TT；c-APTT圖7 不同分子質量海蚌肝素的抗凝血活性Fig.7 Anticoagulant activity of mussel heparin with different molecular weights 注：與生理鹽水相比,*表示差異顯著,P<0.05；**表示差異極顯著,P<0.01

2.3.3 纖溶活性

采用瓊脂糖凝膠纖溶平板法評價不同分子質量海蚌肝素的纖溶活性。不同濃度尿激酶產生的溶圈大小(x)與纖溶活性(y)的指數方程為y=0.058 5e1.243 6x,R2=0.994 3,相關性良好。測得不同分子質量海蚌肝素與商品肝素的纖溶活性如表2所示。海蚌肝素和商品肝素的纖溶活性均隨著分子質量的降低而增大。測得海蚌肝素中DG2纖溶活性最強,DG1次之,G2最小；商品肝素LMWH的纖溶活性遠高于HP,約為HP的6倍。DG2的纖溶活性約為HP的77%,而遠低于LMWH,僅為LMWH的13%。

表2 不同分子質量海蚌肝素纖溶活性分析Table 2 Analysis of fibrinolytic activity of mussel heparin with different molecular weights

3 結論與討論

冠心病、腦卒中等血栓性疾病已經成為嚴重的公共衛生問題[24]。正常生理狀態下,血液處于凝結與纖溶的動態平衡中,而當疾病、藥物和不合理膳食等危險因素出現而使內皮細胞損傷時,血液成分和血液流變學性質發生變化,血液傾向于凝結而形成血栓。故抗血栓活性的研究常從纖溶與抗凝血活性的角度進行。肝素的抗血栓活性與分子質量有關，不同分子質量的肝素的抗血栓活性具有不同的作用途徑及特點,可應用于不同血栓性疾病的治療。此外,肝素是一種多糖,活性也受結構的影響[25]。

本文對不同分子質量海蚌肝素G2、DG1、DG2的結構特性和抗凝血、纖溶活性進行了研究。結果表明海蚌肝素G2、DG1、DG2的重均分子質量分別為60.25 kDa(大分子質量)、24.48 kDa(普通分子質量)、6.75 kDa(低分子質量)；紅外色譜顯示,降解前后海蚌肝素的官能團結構變化不明顯,但隨著分子質量的降低,官能團或特征峰峰值增加,降解并沒有破壞海蚌肝素的基本結構和活性基團；降解前后海蚌肝素的高級結構變化明顯,隨著分子質量降低,海蚌肝素的圓二色譜峰峰值變小,掃描電鏡圖譜顯示海蚌肝素的碎片狀結構及球狀結構增加,原子力顯微鏡圖顯示海蚌肝素的網線狀結構先被降解成鏈狀結構,后聚集成顆粒結構；DG1的抗Xa/IIa比值最大,為2.13；通過測定APTT、TT、PT值,發現DG2與G2的抗凝血活性接近,但DG2的抗凝活性顯著降低,這可能與不同海蚌肝素的分子質量有關,此外G2、DG1、DG2的抗凝活性明顯弱于肝素,提示不同分子質量海蚌肝素可能具有較低的出血副作用；隨著分子質量的降低,纖溶活性升高,DG2的纖溶活性約為HP的77%,LMWH的13%。綜上所述,不同分子質量的海蚌肝素的基本結構和活性基團一致,但具有不同的高級結構特征,緩和的抗凝血活性和良好的纖溶活性,可能具有較低的出血副作用和作用途徑不同的更強的抗血栓活性,有利于開發更為安全的抗血栓活性物質。今后將進一步分析不同分子質量海蚌肝素的體外抗血小板聚集和體內抗血栓活性,為尋找更加安全、有效的抗血栓藥物提供一定的理論依據。