miR-376c-3p通過靶向谷氨酸受體相互作用蛋白1影響乳腺癌細胞的增殖和遷移

王超， 高雨婷， 劉子瑤， 李濤， 王晶哲， 劉璐， 謝巖， 孫曉春

(江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013)

世界衛生組織國際癌癥研究機構最新發布的2020年全球癌癥負擔數據顯示，乳腺癌新發病例高達226萬例，超過肺癌的220萬例，成為全球第一大癌[1]。隨著乳腺癌手術、化療、放療、內分泌治療、免疫治療及多種聯合治療策略的應用，乳腺癌患者的生存期明顯延長[2-4]。然而，仍有許多乳腺癌患者最終出現復發、轉移和耐藥。

微小RNAs(microRNAs, miRNAs)是一類微小、內源性調節多種生物作用的非編碼RNA，參與細胞分化、器官發育、信號轉導以及腫瘤發生發展等多種生物學過程[5]。研究發現，miRNAs在多種腫瘤中存在異常表達，并且在腫瘤的增殖、侵襲和轉移、血管生成、耐藥性以及上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)進程中起重要作用[6-8]。miR-200家族在癌癥中的異常表達及其參與EMT進程已得到充分研究。在浸潤性乳腺癌中，miR-200與E-鈣黏蛋白水平顯著相關[9]；miR-200家族成員的過表達導致E-鈣黏蛋白表達上調，并通過靶向轉錄因子ZEB1和鋅指結構E-bok-結合同源框2(ZEB2)抑制EMT進程[10]；miR-145可以通過直接調節N-鈣黏蛋白和ZEB2表達抑制胃癌EMT進程[11]。

研究表明，miR-376c-3p在胃癌[12]、肝細胞癌[13]、神經母細胞瘤[14]和口腔鱗癌[15]等多種腫瘤中呈異常表達。miR-376c-3p在抑制胃腫瘤生長及腫瘤相關基因表達中具有重要作用，其在胃癌中表達下調，可靶向SYF2從而抑制胃癌細胞的增殖和遷移[12]。過表達hsa-miR-376c-3p可促進胃癌細胞凋亡和G1期阻滯[16]。miR-376c-3p通過靶向同源框B7(HOXB7)抑制人口腔鱗癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡[15]。研究發現，miR-376c-3p在三陰性乳腺癌中表達下調[17]，但其在乳腺癌中的作用并不明確。因此，本研究中檢測其在乳腺癌中的表達水平以及生物學功能，并結合生物信息學探討其分子調控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器

人乳腺上皮細胞系MCF-10A購于上海富衡細胞庫；人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。MEGM(瑞士Lonza/Clonetics公司)；H-DMEM(美國Gibco公司)；胎牛血清(以色列BI公司)；胰酶(美國Sigma公司)；Trizol及LipofectamineTM3000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；PowerUpTMSYBRTMGreen實時熒光定量PCR試劑盒、熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；鏈霉素、青霉素、蛋白質裂解液RIPA、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、兔抗人E-鈣黏蛋白抗體以及兔抗人波形蛋白抗體均購自上海碧云天公司；兔抗人谷氨酸受體相互作用蛋白1(GRIP1)抗體(美國SAB公司)；兔抗人GAPDH抗體(美國CST公司)；HRP標記羊抗兔IgG(上海愛必信公司)。CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(美國Biotek公司)；化學發光凝膠成像分析系統(美國GE公司)。

1.2 細胞培養和細胞轉染

在MEGM中加入100 ng/mL霍亂毒素配制成MCF-10A完全培養基，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養人乳腺上皮MCF-10A細胞。

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的H-DMEM，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞。取生長狀態良好的MCF-7和MDA-MB-231細胞常規消化，用無雙抗的H-DMEM完全培養基重懸制成單細胞懸液，計數并調整細胞濃度為1×105/mL，在6孔板中加入2 mL細胞懸液，置于37 ℃恒溫、5% CO2的飽和濕度培養箱中繼續培養；次日待貼壁細胞融合度達到70%左右時根據LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行轉染。

實驗設陰性對照、miR-376c-3p mimic組，每組3個復孔。在EP管中用125 μL無血清培養基稀釋7.5 μL的LipofectamineTM3000，在另外EP管中用125 μL無血清培養基稀釋100 pmol miR-376c-3p mimic或陰性對照RNA序列；將稀釋的mimic或陰性對照RNA序列加入至稀釋的LipofectamineTM3000中，室溫孵育10～15 min；加入到含有1.75 mL無雙抗完全培養基的人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞中輕柔搖勻。轉染6 h左右，根據細胞情況進行換液，進行后續實驗。

1.3 qRT-PCR檢測乳腺上皮和乳腺癌細胞中miR-376c-3p表達水平

按照Trizol試劑說明書提取總RNA，用紫外分光光度儀測定所提RNA濃度。按逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，隨后以cDNA為模板進行PCR擴增引物，并以U6作為內參，實驗設3個復孔，重復3次。所用引物由上海生工生物設計并合成，具體序列如下，miR-376c-3p：上游5′-CGCGCG AACATAGAGGAAATT-3′，下游5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3；U6：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qRT-PCR反應條件：50 ℃ 尿嘧啶-DNA糖基化酶激活2 min；95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環。通過2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

1.4 平板克隆實驗檢測乳腺癌細胞克隆能力

MCF-7和MDA-MB-231細胞轉染6 h后，常規消化收集，計數并調整細胞濃度至500個/孔接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2孵箱內培養3～4 d換液；培養10～14 d，PBS洗2～3次，4%多聚甲醛固定細胞30 min；PBS洗2～3遍；結晶紫染色15 min；PBS洗2～3遍；拍照計數并統計分析。

1.5 劃痕實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力

MCF-7和MDA-MB-231細胞在6孔板轉染后，待細胞融合度達到90%以上時，用200 μL槍頭在6孔板中劃3條直線，再用無血清培養液漂洗直到無漂浮的細胞為止，置于倒置顯微鏡下觀察并隨機選取3個視野拍照(0 h)，37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.6 Transwell遷移實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力

在MCF-7和MDA-MB-231細胞轉染48 h后，常規消化收集細胞，計數并調整細胞濃度至5×105/mL，在Transwell下室內加入800 μL含10%胎牛血清的H-DMEM完全培養基，在Transwell上室內加入100 μL細胞懸液，于37 ℃、5% CO2孵箱內培養16～24 h；吸干上室內液體，用棉簽輕柔除去上室內未遷移細胞，于4%多聚甲醛中固定30 min；結晶紫染色30 min；于顯微鏡下隨機觀察5個視野，并進行計數和統計。

1.7 生物信息學分析

通過Starbase網站(http://starbase.sysu.edu.cn/)對miR-376c-3p進行檢索，預測其靶基因；然后將預測到的靶基因作為研究對象，使用OncoLnc在線生存分析網站(http://www.oncolnc.org/)對TCGA數據庫中浸潤性乳腺癌(breast invasive carcinoma，BRCA)進行生存分析，根據GRIP1表達水平中位數將BRCA患者分為GRIP1高表達組與GRIP1低表達組。

1.8 蛋白質印跡實驗檢測GRIP1、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達水平

在MCF-7和MDA-MB-231細胞轉染48 h后，PBS洗2～3遍，加入200 μL RIPA裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)裂解細胞，收集細胞裂解液，全程冰上操作；4 ℃，12 000×g離心15 min，取上清液，并用BCA蛋白濃度檢測試劑盒定量濃度；根據濃度加入上樣緩沖液，100 ℃熱變性10 min，分裝于-20 ℃保存備用。取50 μg蛋白行10% SDS-PAGE分離蛋白，80 V電泳30 min，待溴酚藍顯示于下層膠后將電壓調至110 V，適時終止電泳；然后，以300 mA濕轉120 min至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入兔抗人GRIP1抗體、兔抗人E-鈣黏蛋白抗體、兔抗人波形蛋白抗體、兔抗人GAPDH抗體(內參)，均1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；HRP標記羊抗兔二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，每次10 min；加入ECL曝光液顯影、拍攝并計算灰度值。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 miR-376c-3p在乳腺癌細胞中呈低表達

qRT-PCR檢測結果顯示，與人正常乳腺上皮MCF-10A細胞相比，miR-376c-3p在乳腺癌MCF-7細胞(t=19.460，P<0.01)和MDA-MB-231細胞(t=34.940，P<0.01)中的表達水平顯著降低(圖1)。

圖1 qRT-PCR法檢測miR-376c-3p在不同乳腺細胞系中的表達水平

2.2 miR-376c-3p過表達抑制乳腺癌細胞增殖

qRT-PCR結果顯示，miR-376c-3p mimic組乳腺癌MCF-7細胞(t=-15.542，P<0.01)和MDA-MB-231細胞(t=-12.072，P<0.01)miR-376c-3p表達顯著上調(圖2)。平板克隆形成實驗結果顯示，與陰性對照組相比，miR-376c-3p mimic組MCF-7細胞(t=4.492，P<0.05)和MDA-MB-231細胞(t=9.055，P<0.01)克隆形成的集落數量明顯減少(圖3)，提示miR-376c-3p能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖能力。

圖2 qRT-PCR法檢測miR-376c-3p mimic轉染效率

圖3 miR-376c-3p對乳腺癌細胞克隆形成能力的影響

2.3 miR-376c-3p過表達抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲能力

Transwell遷移實驗結果顯示，與陰性對照組相比，miR-376c-3p mimic組MCF-7細胞(t=9.999，P<0.01)以及MDA-MB-231細胞(t=9.773，P<0.01)的遷移細胞數顯著減少(圖4)。劃痕實驗結果顯示，與陰性對照組相比，miR-376c-3p mimic組MCF-7細胞(t=6.042，P<0.01)和MDA-MB-231細胞(t=5.257，P<0.01)劃痕愈合率顯著降低(圖5)。

圖4 miR-376c-3p對乳腺癌細胞遷移能力的影響(×100)

圖5 miR-376c-3p對乳腺癌細胞劃痕愈合率的影響(×40)

2.4 miR-376c-3p靶向GRIP1調控乳腺癌細胞EMT相關蛋白的表達

通過生物信息學Starbase網站預測發現miR-376c-3p與GRIP1存在相互結合位點(圖6)；生存分析結果顯示，GRIP1高表達組BRCA患者的總體生存期明顯縮短(Cox系數=0.214，P<0.05)，GRIP1高表達與患者預后不良有關(圖7)。

圖6 miR-376c-3p與GRIP1相互結合位點

圖7 GRIP1表達與BRCA總體生存期的關系

蛋白質印跡實驗結果顯示，與陰性對照組相比，miR-376c-3p mimic組乳腺癌細胞GRIP1蛋白表達水平顯著降低(MCF-7細胞t=10.240，MDA-MB-231細胞t=4.913，P均<0.05)；與此同時，EMT相關蛋白E-鈣黏蛋白表達水平明顯增高(MCF-7細胞t=12.440，MDA-MB-231細胞t=6.444，P均<0.01)，波形蛋白表達顯著降低(MCF-7細胞t=12.360，MDA-MB-231細胞t=9.023，P均<0.01)。見圖8。由此可見，miR-376c-3p可能通過靶向GRIP1抑制乳腺癌細胞EMT進程。

圖8 蛋白質印跡實驗檢測乳腺癌細胞中相關蛋白的表達水平

3 討論

研究表明，miRNAs是腫瘤惡性轉化和轉移的重要調控因子[18]。本研究中miR-376c-3p在乳腺癌細胞中表達下調，且下調水平與乳腺癌細胞的惡性程度相關，與之前報道一致[16]。由此提示，miR-376c-3p可能作為乳腺癌新的診斷分子標志物，其表達下調極有可能參與調控乳腺癌的發生發展。為探討miR-376c-3p在乳腺癌中的生物學功能，本研究利用miR-376c-3p mimic轉染乳腺癌MCF-7以及MDA-MB-231細胞，結果顯示外源性過表達miR-376c-3p可以顯著抑制乳腺癌細胞的生長。此外，Transwell遷移實驗以及細胞劃痕實驗顯示，上調乳腺癌細胞中miR-376c-3p表達可以顯著抑制細胞的遷移能力。由此表明，在乳腺癌進展中，miR-376c-3p可以作為腫瘤抑制因子抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。然而，在肝細胞癌中miR-376c-3p可能發揮致癌作用促進腫瘤進展[13]，這可能與腫瘤的異質性以及不同的分子調控機制有關。

miRNAs可通過靶向mRNAs序列的3′-非翻譯區廣泛參與多種基因的轉錄后調控過程，進而影響細胞的生物學功能。為進一步分析miR-376c-3p在乳腺癌中的調控機制，本研究通過在線生物信息學網站預測到GRIP1是miR-376c-3p的潛在靶基因；進一步實驗發現，miR-376c-3p靶向GRIP1基因調控GRIP1蛋白表達，同時影響乳腺癌EMT相關蛋白的表達水平，進而調控乳腺癌的生物學行為。通過生存分析發現，GRIP1表達水平與乳腺癌患者生存期呈顯著負相關，然而，其在乳腺癌中的作用并未明確。此前有報道稱，GRIP1可以通過與14-3-3蛋白間相互作用，從而調控神經元物質運輸[19]。研究表明，14-3-3蛋白在多種腫瘤中呈異常表達[20]，與乳腺癌轉移風險密切相關[21-22]，有望成為提示乳腺癌患者總生存期和無復發生存期的預后生物標志物[23]。然而，GRIP1是否可以通過14-3-3蛋白進而影響乳腺癌的進展及作用機制尚未明確，仍需深入研究。

綜上所述，本研究結果表明miR-376c-3p可能作為腫瘤抑制因子通過靶向GRIP1調控乳腺癌細胞的增殖、遷移以及EMT進程。但是，本研究僅在體外乳腺癌細胞中進行，仍需在臨床樣本中研究miR-376c-3p對乳腺癌的診斷價值。此外miR-376c-3p與GRIP1在乳腺癌中的生物學功能以及相關信號轉導通路的激活還有待于后續進一步研究。