9種植物源多酚的分離提取及其澀感評價

劉佩 杜國榮 趙鵬濤 張倩婷 王升楠 王曉宇

摘要： 為探究不同植物源多酚物質的理化性質差異及其感官潛質，以9種不同植物材料為研究對象，經提取、分離和純化后獲得多酚提取物，并對其總酚含量、總黃烷醇含量、鞣花單寧含量、蛋白質結合能力、蛋白質沉降能力、澀感及顏色等指標進行分析。結果表明，在9種植物原料中，綠茶、紅茶、石榴皮和木瓜皮中總酚物質含量較高，是酚類物質提取的優質原料。唾液蛋白沉降指數（SPI）試驗結果表明，供試多酚提取物的蛋白質沉降能力與其總酚含量呈正相關關系。鞣花單寧通過影響蛋白質結合能力進而影響多酚提取物的澀感強度。

關鍵詞： 多酚;鞣花單寧;澀感;蛋白質結合能力

中圖分類號： TS255.1?? 文獻標識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2021）04-1025-08

Separation and extraction of nine plant polyphenols and evaluation of astringency

LIU Pei1， DU Guo-rong2， ZHAO Peng-tao1，3，4， ZHANG Qian-ting1， WANG Sheng-nan1， WANG Xiao-yu1，3，4

（1.College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian 710119， China;2.School of Biological and Environmental Engineering， Xian University， Xian 710065， China;3.National Research & Development Center of Apple Processing Technology， Xian 710119， China;4.Engineering Research Center of High Value Utilization of Western China Fruit Resources， Xian 710119， China）

Abstract： In order to explore the differences in physicochemical properties and organoleptic quality of polyphenols extracted from different plant sources， nine different plant materials were studied. After extraction， separation and purification， the polyphenol extracts were obtained， and its total phenol content， total flavanol content， ellagitannin content， protein binding capacity， protein sedimentation capacity， astringency and color were analyzed. The results showed that among the nine plant materials， green tea， black tea， pomegranate peel and papaya peel had high total phenol content， which were high-quality raw materials for polyphenols extraction. The results of salivary protein sedimentation index （SPI） test showed that the protein sedimentation capacity of the tested polyphenol extract was positively correlated with total phenol content. Ellagitannin affects the astringency intensity of polyphenol extracts by affecting the protein binding capacity.

Key words： polyphenols;ellagitannin;astringency;protein binding capacity

多酚是高等植物的次級代謝產物，其結構復雜，具有多種功效，能夠調節免疫系統，預防高血糖和高血脂等慢性疾病[1-2]。植物中的酚類物質不僅具有保健作用，還可通過鍵合作用與蛋白質相互作用形成復合物，并影響茶、咖啡、葡萄酒、啤酒等飲料食品的風味和色澤[3-5]。如從五味子、橡木、綠茶及葡萄籽中提取的多酚化合物[6]，可用于改善葡萄酒的澀感與顏色[7-8]。澀感是由多酚與唾液蛋白結合所形成干燥、粗糙、褶皺的味感，對食品獨特口感的形成起到了不可替代的作用[9]，多酚與蛋白質的相互作用也是近年來的研究熱點[10]。

食品加工副產物中的酚類物質雖受到研究學者的關注，但主要集中于多酚物質的抗氧化功能，而對多酚物質的感官特性研究較少。一些植物廢棄物如板栗殼、葡萄皮、葡萄籽，其多酚提取物常作為添加劑用于葡萄酒釀造，以調節葡萄酒的澀感及顏色，提升其感官品質。許多植源性食物富含多酚類物質，具有巨大的應用潛力，但其多酚類物質的利用率較低，且在加工中許多副產物常被作為生產垃圾廢棄，造成了資源浪費和環境污染問題。因此研究植物多酚物質的理化特性與其感官潛質具有一定意義。

目前，從綠茶、板栗殼、葡萄皮、葡萄籽中提取的多酚是市場上應用較廣的食品添加劑，通過前期的試驗研究發現石榴皮、木瓜皮、山楂、紅茶和高粱殼是優質的酚類提取原料且具有應用潛力。因此，本試驗以這9種植物源多酚為研究對象，對其酚類物質進行提取、純化后獲得多酚提取物，并在測定其總酚含量、總黃烷醇含量的同時，通過熒光光譜法和聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）來研究多酚與蛋白質的結合和沉降能力，通過色差測定和感官鑒評對多酚提取物的顏色及澀感進行分析，為其作為食品添加劑用于調節食物的色澤和味感提供理論依據，以期挖掘這些植物資源的應用潛力，提高綜合利用效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴、紅茶、板栗、高粱殼、葡萄、木瓜皮、綠茶、山楂，購自華潤萬家超市;福林酚試劑、對二甲氨基肉桂醛（DMACA）、考馬斯亮藍（R250）、牛血清白蛋白（BSA，98%）、三羥甲基氨基甲烷（TRIS），美國Sigma公司產品;氯化鈉、碳酸鈉、濃鹽酸、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙三醇、甲醇、冰乙酸，購自天津天力化學試劑公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液，購自北京索萊寶科技有限公司;低相對分子質量標準蛋白質（1.0×104～1.80×105），購自中國科學院上海生物化學研究所。

RF-6000型熒光分光光度計，上海分析儀器廠產品;DYCZ-24DN 電泳儀，北京六一儀器廠產品;KQ 5200DE RE-52旋轉蒸發器，上海安亭科學儀器廠產品;TGL-16B高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產品;UV2600A紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司產品;SC-80C全自動色差儀，北京康化儀器有限公司產品;LGJ-18C真空冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠產品; 高效液相色譜儀（DAD）U-3000，美國熱電公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 多酚物質的提取 對試驗材料進行前處理，獲得石榴皮、紅茶、板栗殼、高粱殼、葡萄皮、木瓜皮、葡萄籽、綠茶和山楂皮，再將它們置于35 ℃烘箱中烘干。除葡萄籽外，對其他樣品進行破碎。再取上述9種樣品各10 g，置于盛有100 ml 70%乙醇的三角瓶中，將三角瓶置于轉速為180 r/min的搖床中浸提5 h，之后經布式漏斗過濾、旋轉蒸發儀蒸發除去乙醇后用蒸餾水定容到50 ml，即得到酚類物質粗提液，置于4 ℃的冰箱中保存備用。

1.2.2 多酚物質的純化 AB-8大孔樹脂經95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，置于玻璃層析柱中，用95%乙醇流動清洗至無渾濁，再用蒸餾水沖洗。將酚類粗提液上柱，靜置吸附飽和后，用蒸餾水洗脫除去蛋白質、多糖等雜質，洗脫液pH為7時即為洗脫終點，再用2倍柱體積的60%乙醇進行洗脫[11]。將洗脫液旋蒸濃縮后，轉移至真空冷凍干燥機進行干燥處理后低溫保存。

1.2.3 理化指標的測定

1.2.3.1 總酚、總黃烷醇含量測定 總酚含量測定采用福林酚法[12]，總酚含量以沒食子酸計（mg/L），以沒食子酸標準溶液濃度為橫坐標，以在765 nm波長處所測吸光值為縱坐標，所得標準曲線方程為Y=0.001 4x-0.000 6，R2=0.999 2。總黃烷醇含量測定采用4-（二甲基氨基）肉桂醛法（DMACA）[13]，總黃烷醇含量以兒茶素計（mg/L），以兒茶素標準溶液濃度為橫坐標，以在640 nm波長處所測吸光值為縱坐標，所得標準曲線方程為Y=0.009 3x-0.004 2，R2=0.999 7。所有指標均重復測定3次，將吸光度代入標準曲線回歸方程計算溶液中總酚、總黃烷醇含量，按公式（1）計算總酚、總黃烷醇提取率。

W=C×Vm（1）

式中，W為多酚（總黃烷醇）提取率（mg/g），C為提取液中多酚（總黃烷醇）的質量濃度（mg/ml），V為提取液的總體積（ml），m為取樣量（g）。

1.2.3.2 鞣花單寧含量測定 鞣花單寧含量測定采用高效液相色譜（HPLC）法。先配制不同多酚提取物甲醇溶液，調整其質量濃度為5 g/L，取1 ml多酚提取物甲醇溶液與1 ml濃鹽酸（2 mol/L）在100 ℃下反應2 h[14]。色譜條件如下：Waters XBridge Shield RP18柱（4.6 mm×250.0 mm， 3.5 μm），檢測波長為370 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μl，流速為0.6 ml/min。以2%甲酸為水相，以乙腈為有機相，洗脫梯度：0～5 min，0～10%乙腈; 5～10 min，10%～25%乙腈; 10～40 min，25%～35%乙腈。

1.2.3.3 SDS-PAGE分析 唾液的收集與處理參考Zhang等的方法[15]，招募4名身體健康且不抽煙的志愿者參加試驗，其中男女比例為1∶1，于上午11∶00左右收集其唾液（要求收集前2 h不得攝入食物和飲料）并且混合，然后用離心機在10 000 r/min的條件下離心5 min，取其上清液即為所需的唾液蛋白樣品（SP）。

用SDS-PAGE對唾液蛋白進行分離、分析，其中相對分子質量5.4×104～5.9×104和1.5×104附近的蛋白質與澀感相關性最高。用相機將脫色后的凝膠進行拍照，再用化學發光成像儀器對圖片進行光分析，記錄光密度值，計算樣品與唾液蛋白結合前、后蛋白質條帶（5.4×104～5.9×104和1.5×104）光密度值降低的百分比，即得到唾液蛋白沉降指數（SPI）[16]，用來分析葡萄酒與蛋白質的結合能力，預測澀感強度。

樣品前處理：分別取9種多酚提取物溶于30%的乙醇，得到2 g/L的多酚乙醇溶液，將其與唾液蛋白（HS）以1∶2（V/V）的比例進行混合并反應5 min，之后在離心力為10 000 g的條件下離心10 min，將上清液與4×上樣緩沖液以3∶1（V/V）的比例混合后煮沸5 min [17]。

測定條件：Marker上樣量為10 μl，樣品15 μl;初始電壓為100 V，通過分離膠區域時電壓調整為120 V;經0.1%的考馬斯亮藍染色后，在脫色液（10%冰乙酸，10%甲醇）中脫色，每30 min更換一次脫色液，直至脫色液無色為止。

1.2.3.4 熒光光譜分析 取10 mg多酚提取物與10 ml的5×10-6mol/L的BSA溶液充分混合后靜置5 min使其充分反應，之后在280 nm的波長處進行光譜掃描，掃描速度為600 nm/min，激發和發射狹縫寬度分別為5 nm和10 nm，數據間隔為0.2 nm，波長范圍為285～450 nm。

1.2.3.5 感官鑒評 感官鑒評小組由11名經過專門感官訓練的食品專業學生組成。小組成員首先接受培訓，使他們熟悉澀感強度范圍。首先采用硫酸奎寧（0.25 g/L）、硫酸鋁（3.00 g/L）、和酒石酸（4.00 g/L）水溶液來確定苦味、澀味和酸味。再分別用50 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L和4 000 mg/L的硫酸鋁對小組成員進行收斂性培訓，確定主要感受到的收斂性濃度范圍。按照0～10分制對不同質量濃度的單寧模型溶液（50 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L和3 000 mg/L）的收斂性進行評估（表1），以確定成員在品嘗不同樣品之間的重復性[18]。感官品嘗環境為室溫，品嘗溶液為10 ml溶于30%乙醇的多酚溶液（1 g/L），保持8 s后吐出，之后用去離子水清潔口腔2次，等待30 s后品嘗下一個樣品。每個多酚溶液的評價在5 min內完成，按照培訓的標準對澀感進行評分[19]。

1.2.3.6 多酚溶液顏色的測定 利用色差計測定不同多酚溶液顏色參數：亮度 （L*），其值越大，亮度越高;紅度 （a*），正值表示接近紅色，負值表示接近綠色;黃度 （b*），正值表示接近黃色，負值表示接近藍色。總色差 （△E*） 使用下列公式（2）計算：

△E*= （△L*）2+（△a*）2+（△b*）2（2）

式中，△L*、△a*和△b*是處理樣品顏色值與空白對照樣品顏色值之間的差值。

1.3 數據處理

各試驗組均重復3次，測定結果用“平均值±標準差”表示。數據進行單因素方差分析（ANOVA）、Pearson相關性分析以及Duncans顯著性分析。P<0.05為顯著性。數據用SPSS 18.0處理，圖、表使用originPro 9繪制。

2 結果與分析

2.1 不同原料中酚類物質含量的比較

不同食物原料中酚類物質的含量差異見圖1。由圖1可知，綠茶、紅茶和石榴皮的總酚含量較高，均達到50 mg/g以上;而葡萄籽、木瓜皮和山楂皮的總酚含量為20～35 mg/g，葡萄皮、板栗殼和高粱殼的總酚含量較低，均低于20 mg/g;葡萄皮、籽的總酚含量分別為13.12 mg/g和21.76 mg/g，與Canals等人的研究結果基本一致[20]。綠茶和紅茶中黃烷醇類物質含量較高，分別為13.79 mg/g和13.74 mg/g，這是由于綠茶中兒茶素含量占茶多酚總量的70%～80%， 紅茶中含有較多的茶黃素等黃烷醇氧化產物[21-22]。葡萄籽、木瓜皮和山楂皮的總黃烷醇含量為7.25～9.61 mg/g，葡萄皮、板栗殼、石榴皮和高粱殼的總黃烷醇含量較低，其含量為1.26～2.47 mg/g。石榴皮的總酚含量很高，但是總黃烷醇含量較低，可能是因為石榴皮中的多酚主要是水解單寧[23]。

2.2 多酚提取物中總酚、總黃烷醇含量

酚類化合物通常被分成2類：類黃酮物質和非類黃酮物質。類黃酮包括花青素和黃烷醇，其中黃烷醇是苦味以及與收斂性相關的主要成分。不同原料多酚提取物中總酚、總黃烷醇含量差異見圖2。從圖2可知，9種多酚提取物中的總酚含量在250.43～523.05 mg /g。多酚提取物中總酚含量由高到低分別是石榴皮、山楂皮、木瓜皮、板栗殼、葡萄皮、葡萄籽、綠茶、紅茶、高粱殼，分別為523.05 mg /g、464.95 mg /g、425.19 mg /g、390.90 mg /g、306.14 mg /g、302.81 mg /g、263.29 mg /g、254.24 mg /g和250.43 mg/g。由圖2可知，總黃烷醇含量最低和最高的是石榴皮和葡萄籽多酚提取物，含量分別為13.71 mg /g和172.57 mg /g，這是因為葡萄籽中含有較多的兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯等黃烷醇類物質，而石榴皮多酚提取物中黃烷醇含量很少[24-26]。

2.3 多酚提取物中鞣花單寧含量

植物中單寧按結構可分為縮合單寧和水解單寧，縮合單寧由黃烷-3-醇單體、二聚體以及高聚物組成，水解單寧是葡萄糖的單糖酯連接至少一個沒食子酸（沒食子單寧）或鞣花酸（鞣花單寧）形成。多年來，縮合單寧一直被認為是與收斂性有關的單寧，但一些人類感官試驗結果表明鞣花單寧也可影響收斂性 [27]。多酚提取物中鞣花單寧含量見圖3，在葡萄籽、葡萄皮、木瓜皮和山楂皮中未檢測到鞣花單寧，高粱殼、綠茶和紅茶中鞣花單寧含量均低于5 mg/g，板栗殼和石榴皮中鞣花單寧含量分別為25.27 mg/g和46.90 mg/g。此結果與其他研究學者的試驗結果基本吻合，Russo等[28]和張建偉等[29]分別發現石榴皮和板栗殼中的鞣花單寧含量豐富。

2.4 不同多酚提取物與蛋白質沉降能力的比較

對不同多酚提取物進行電泳分析，測定在1.5×104和5.4×104～5.9×104這2條蛋白質條帶處的光密度值，并計算唾液沉降指數（SPI）（圖4）。由圖4可知，木瓜皮、石榴皮、高粱殼和山楂皮多酚提取物的SPI較高，表明其蛋白質沉降能力較強;葡萄皮、葡萄籽、紅茶和綠茶多酚提取物的SPI較低。以9種不同多酚提取物的多酚含量為橫坐標，SPI為縱坐標，所得線性擬合方程為Y=0.169 1x-6.757 2，R2=0.934 5，表明總酚含量與SPI存在正相關性，多酚提取物中總酚含量越高，其與蛋白質的沉降能力越強。

2.5 不同多酚提取物與蛋白質的結合能力

由9種多酚提取物與BSA相互作用后的熒光光譜峰值（圖5）可知，與蛋白質結合能力從強到弱依次為石榴皮、木瓜皮、板栗殼、高粱殼、紅茶、綠茶、葡萄籽、山楂皮和葡萄皮多酚提取物。由以9種不同多酚提取物與BSA的熒光差值為橫坐標，分別以總酚含量、總黃烷醇含量和鞣花單寧含量為縱坐標，進行Pearson擬合，得到R2分別為0.006 27、0.426 21和0.213 93，表明多酚提取物與蛋白質結合能力與總酚含量、總黃烷醇含量和鞣花單寧含量不構成線性關系。由圖2與圖3可知，總酚和總黃烷醇含量較高的多酚提取物表現出較低的蛋白質結合能力，而鞣花單寧含量較高的多酚提取物卻表現出很高的蛋白質結合能力，表明總酚與總黃烷醇對多酚提取物蛋白質結合能力的影響較小，但鞣花單寧會影響蛋白質結合能力。板栗殼和石榴皮的多酚提取物蛋白質結合能力較強，可能是因為它們含有大量鞣花單寧會通過疏水作用和氫鍵與BSA結合生成不具有熒光特性的復合物[30]。上述結果表明多酚提取物中總酚含量與蛋白質結合能力關系不大，但與多酚的種類具有一定的關聯。

2.6 不同食物源多酚提取物的澀感

不同多酚提取物的澀感差異見圖6，多酚提取物澀感評分由低到高分別為石榴皮、板栗殼、木瓜皮、高粱殼、紅茶、綠茶、葡萄籽、山楂皮和葡萄皮多酚提取物。9種多酚提取物中，石榴皮澀感強烈;板栗殼、木瓜皮、高粱殼和紅茶澀感較強，口感粗糙;綠茶、葡萄籽和山楂皮多酚提取物有干燥、褶皺的味感;葡萄皮多酚提取物澀感較弱。以9種不同多酚提取物與BSA熒光差值為橫坐標，澀感強度為縱坐標，所得線性擬合方程為Y=1.331 4x+4.058 8，R2=0.933 9，多酚提取物的澀感強度與其熒光差值呈正相關關系，表明多酚提取物澀感強度與其蛋白質結合能力存在一定的相關性。

2.7 不同食物源多酚提取物的色度

不同多酚提取物的顏色差異見表2。對色澤指標 L*、 a*、 b*和總色差值△E分別進行Duncans顯著性分析，結果顯示除葡萄籽和板栗殼以外的多酚提取物L*值間均存在顯著差異，除葡萄籽和紅茶以外的酚提取物a*值差異顯著，除葡萄籽和石榴皮以外的多酚提取物b*值差異顯著，葡萄籽和山楂皮以外多酚提取物的△E*間存在顯著差異。

以9種不同多酚提取物的顏色參數L*、 a*、 b*和△E*作為橫坐標，分別以總酚含量、總黃烷醇含量和鞣花單寧含量為縱坐標，進行Pearson擬合，得到的12組R2值均小于0.6，表明多酚提取物顏色參數與總酚含量、總黃烷醇含量和鞣花單寧含量無線性關系。

由表2可知葡萄皮和高粱殼多酚提取物的a*值較高但L*值較低，表明它們的透光性因紅色較深而相對較差，這與葡萄皮中花色苷含量和高粱殼中紅色素含量較高有一定的關聯[24，30]。紅茶和高粱殼多酚[31]提取物的L*值和b*值均較高，表明黃色對其透光性影響較小。以上結果表明，多酚提取物被應用于食品時，同等添加條件下，9種植物源中葡萄皮和高粱殼多酚提取物會對食物的色澤產生較大影響，其余7種對色澤影響程度相對較小。

3 結論

高粱殼、葡萄皮、木瓜皮等9種植物源提取物的酚類物質含量差異明顯，總酚含量范圍為5.32～69.05 mg/g，其中板栗殼和石榴皮中鞣花單寧含量較高。9種植物提取物的總酚含量與其蛋白質沉降能力呈正相關關系，總酚含量高更容易呈現較強的蛋白質沉降能力。總酚與總黃烷醇含量對多酚提取物的蛋白質結合能力影響不大，而鞣花單寧含量會直接影響多酚提取物的蛋白質結合能力。多酚提取物的澀感強度與其蛋白質的結合能力有一定的關聯，鞣花單寧含量較高的板栗殼和石榴皮的多酚提取物澀感相對較強。對這9種植物多酚的化學性質以及感官特性的研究，可以為這些植物提取的多酚在食品工業中的應用提供理論依據。

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（責任編輯：張震林）

收稿日期：2020-12-18

基金項目：陜西省重點研發計劃項目（2020ZDLNY05-08）;西安市農業項目（20193041YF029NS029）

作者簡介：劉 佩（1996-），女，陜西安康人，碩士研究生，主要從事葡萄酒化學研究。（Tel）17809297966;（E-mail）liupei123@snnu.edu.cn

通訊作者：王曉宇，（E-mail）wangxiaoyu@snnu.edu.cn