添加乳酸菌和纖維素酶對砂仁葉青貯品質的影響

鄭明揚，吳 碩，郭 香，陳曉陽，張 慶

(華南農業大學林學與風景園林學院，廣東木本飼料工程技術研究中心，廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室，廣東 廣州, 510642)

砂仁(Amomumvillosum)屬于姜科豆蔻屬多年生草本植物，是我國“四大南藥”之一，收錄于《中華人民共和國藥典》(2010年版)[1]。原產地中國，品種主要有‘陽春砂’、‘綠殼砂’和‘海南砂’[2]。現代科學表明砂仁有一定的胃腸保護、抗潰瘍、鎮痛、消炎、止瀉、抑菌和抗氧化作用等[3]。Wang和Zhang等[4-5]報道砂仁精油能顯著降低胃酸、胃蛋白酶活性，抑制胃酸分泌和細菌增殖，保護胃腸粘膜，調節胃腸運動。砂仁主要成份為揮發性成分，次要成分為非揮發性成分。其揮發油主要由醋酸冰片(5%～47%)、樟腦(4%～17%)、冰片(1.5%～6%)等組成。非揮發性成分主要由多糖、皂苷類、黃酮類、有機酸、酚類等組成[6-7]。砂仁擁有非常多的有益活性成分，可作為飼料添加。李喬仙等[8]發現砂仁鮮莖葉適口性好、營養價值高，可作為牛、羊等草食動物的青貯飼料。韓建成等[9]發現在飼料中添加10%的砂仁莖葉，對雷州黑山羊的生長有積極作用。閆長東[10]發明了一種新型砂仁飼料(最外層由砂仁粉構成)，能提高家禽的食欲和提高飼料的營養品質。

青貯前期pH值能否快速下降對青貯品質影響至關重要。通過添加乳酸菌制劑能迅速降低pH值，乳酸菌在發酵前期與其他菌種競爭中獲得優勢并抑制有害微生物的活性從而提升青貯飼料的發酵品質[11]。纖維素酶和木聚糖酶等酶制劑常用于改善粗飼料的青貯品質[12]。添加纖維素酶，能使纖維水解為葡萄糖[13]，增加乳酸菌的發酵底物。木聚糖酶可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。同時添加乳酸菌和纖維素酶，能幫助pH快速下降，這也是青貯技術發展的一種熱門趨勢[14]。

當前對砂仁的研究主要集中在揮發油成分的鑒定上，而對精油提取后殘渣的利用關注較少。將提取完砂仁精油后的砂仁葉殘渣作為青貯飼料的原料，可以提高砂仁的利用價值，有效緩解家畜飼料短缺的情況[15]，對砂仁葉殘渣作為青貯飼料原料方面，也暫無相關文獻報道。

因此，本試驗通過對提取精油之后的砂仁葉添加乳酸菌和纖維素酶進行青貯處理，來探究添加不同濃度的纖維素酶和乳酸菌，或者纖維素酶和乳酸菌同時添加對砂仁葉青貯品質的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

砂仁葉為精油提取后的剩余材料，由陽江市百盛園實業有限公司生產贈予。纖維素酶和木聚糖酶均購于湖南盛東生物科技有限公司，纖維素酶的酶活為2×104U·g-1、木聚糖酶的酶活為2×105U·g-1。

1.2 試驗設計

本試驗采用完全隨機區組試驗設計，因素一為是否添加乳酸菌LF，添加的劑量為1×106cfu g-1鮮樣(Fresh matter，FM)，因素二為不同的酶處理(分別為0.3%纖維素酶、0.6%纖維素酶、0.2%木聚糖酶、0.4%木聚糖酶)。砂仁葉切碎(長約2 cm)進行青貯處理，添加乳酸菌LF(參照Zhang[16]的研究篩選所得)和不同水平的酶制劑，共10組，每組3個重復，共30袋青貯。CK為對照組(添加等量純水)。飼料混合均勻后，放入實驗室聚乙烯袋(20 cm×30 cm)，然后用真空封口機進行封口，放置在室溫下。青貯30 d后開袋，測定砂仁葉青貯品質和營養物質的各項指標。測定方法參照王成[17]的研究并加以適當修改和補充。

1.3 微生物及化學指標的測定

30 d開袋后，取10 g樣品與90 mL滅菌后的生理鹽水(0.9% NaCl)充分混合，之后取1 mL浸取液加入裝有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，以此方法依次將濃度稀釋為10-2到10-6倍的浸取液。分別用配制好的MRS瓊脂培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基(Violet red bile agar,VRBA)和孟加拉紅培養基(虎紅瓊脂)培養乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)、大腸桿菌、酵母菌以及霉菌，用平板計數法計算各自數量(培養基均來自廣東環凱微生物科技有限公司)。測定pH值和有機酸含量的方式為：取10 g樣品與90 mL滅菌后的生理鹽水充分混合，于4℃冰箱中放置18 h后取出通過濾紙進行過濾，采用雷磁PHS-3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司)測定pH值[18]。剩余液體用0.22 μm孔徑的濾膜進行過濾，測定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)含量(島津GC-14型高效液相色譜儀)[19]。

1.4 纖維和蛋白含量的測定

中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)含量的測定：參照Van Soest的方法[20]進行測定。

可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates,WSC)的測定采用蒽酮比色法[21]。

粗蛋白質(Crude protein,CP)含量的測定：依據凱氏定氮法[22]，準確稱量0.5 g砂仁葉干粉，加入適量濃硫酸和催化劑(硫酸鉀和硫酸銅按5∶1的比例配置)進行消煮，用凱氏定氮儀進行測定。

真蛋白質(True protein,TP)含量的測定：稱取0.5 g砂仁葉干粉，加入15%的三氯乙酸浸泡1 h，再用定性濾紙(無氮)進行過濾，將殘渣無損的轉移到濾紙上，把殘渣連同濾紙一起烘干，按照CP的測定方法進行測定，即能測出真蛋白質的含量[23]。

非蛋白氮(Non-protein nitrogen,NPN)的含量：根據計算公式：NPN=CP-TP，測定CP和TP的含量后即可計算非蛋白氮的含量[23]。

1.5 數據統計

本試驗的數據采用軟件SPSS 19.0 進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，當需要分析兩個因素的交互作用時，采用Duncan法對各組進行比較，P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 青貯原料的特點

由表1可知：砂仁葉青貯飼料干物質(Dry matter，DM)含量為28.3%；粗蛋白質含量為14.9% DM；NDF含量為70.2% DM；ADF含量為43.3% DM；WSC的含量為4.30% DM。乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌、霉菌數量分別為7.48，5.55，6.79和<2.00 log10cfu g-1FM。

表1 青貯原料的特點(± SD,n=3)

2.2 砂仁葉青貯30 d的青貯品質

由表2可知砂仁葉青貯30 d的青貯品質。添加LF和酶制劑(纖維素酶和木聚糖酶)，導致pH值極顯著降低(P<0.01)，LA的含量極顯著增加(P<0.01)。添加LF，LAB的數量略有降低，AA的含量極顯著降低(P<0.01)；有害微生物方面，添加酶制劑后，酵母菌數量極顯著降低(P<0.01)。結果表明，添加LF和酶制劑以及同時兩種處理的交互作用對pH，LA，AA和LAB的含量都有極顯著影響(P<0.01)。

表2 砂仁葉青貯30 d的青貯品質(n=3)

2.3 砂仁葉青貯30 d的營養成分

表3 砂仁葉青貯30 d的營養成分(n=3)

3 討論

3.1 青貯原料的特點

砂仁葉原料中的DM含量接近30%，高于趙苗苗[25]報道的象草DM含量(20.43%)和劉剛等[26]報道的玉米DM含量(16.36%～27.14%)，根據Jessie[27]的報道30%～35%的DM含量最適合青貯。原料中WSC含量為4.30% DM，低于smith[28]的研究中所提到的優質青貯標準，WSC含量較低可能導致發酵底物不足，乳酸菌難以快速繁殖。若乳酸菌不能快速增殖并與有害微生物競爭營養物質成為優勢菌群，可能會引起有害微生物的快速增殖進而引起有氧腐敗[29]。根據李茂等[30]報道，熱帶灌木的NDF和ADF的平均值分別為38.83%，33.67%，而本試驗中砂仁葉原料的纖維含量特別是NDF含量遠大于這個平均值，說明砂仁葉纖維含量高，會影響飼料的適口性，纖維素酶的添加可在一定程度上降低NDF含量，為乳酸菌發酵提供底物。原料中乳酸菌的含量達到了7.48 lg cfu·g-1FM，高于Cai[31]報道的良好青貯飼料的標準(>5.0 lg cfu·g-1FM)，但是大腸桿菌的含量較高(6.79 lg cfu g-1FM)可能會影響飼料的青貯品質。

3.2 砂仁葉青貯30 d的青貯品質

pH值是衡量青貯品質的一個重要指標[32]，當pH值高于4.2時，可能會有更多腐敗現象的產生[33]。本試驗中最高pH值為4.26，其余處理組均低于4.2，說明本試驗中的添加劑處理使砂仁葉達到較好的青貯品質。本試驗中LAB數量減少可能是由于酸化過快導致pH值快速降低，使一些不耐酸的LAB活性受到抑制，Parvin和Nishino[34]也報道了類似的結果。LF的添加使LAB在青貯前期取得優勢競爭地位，纖維素酶的添加使纖維水解，給乳酸菌增加了可發酵的WSC含量，所以LF和酶制劑的處理組中，LA的含量顯著增加，這與Ebrahimi[35]報道的結果一致。酵母菌的產生可能代表著有氧腐敗的開始[36-37]，酶制劑添加組中的酵母菌數量明顯減少，可能是較低的pH值對酵母菌有抑制作用。同時，本試驗中未見大腸桿菌和霉菌產生，說明青貯效果良好。

3.3 砂仁葉青貯30 d后的營養成分

4 結論

在本試驗中，砂仁葉本身的纖維含量高，WSC含量較低，單獨青貯難度較大。添加纖維素酶能將纖維素分解為WSC，解決了乳酸菌發酵底物不足的問題。試驗結果表明：添加LF和2種纖維素酶使砂仁葉青貯的乳酸明顯增加，而pH值、乙酸、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、氨態氮的含量明顯降低，并且抑制了有害微生物酵母菌、大腸桿菌和霉菌。結果表明同時添加LF和0.6%纖維素酶或者同時添加LF和0.4%木聚糖酶都能明顯提高砂仁葉的青貯品質，說明精油提取后的砂仁葉殘渣能夠再利用制作青貯飼料，提高了農副產品利用率。