基于SSR標記的木豆種質資源遺傳多樣性與群體結構分析

陳志祥，羅小燕，李拴林，吳如月，王文強，丁西朋*

(1.海南大學熱帶作物學院，海南 海口 570288；2.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 海口 571101；3.南京農業大學草業學院，江蘇 南京 210095)

木豆(Cajanuscajan)起源于印度，為全球第6大食用豆類，全世界種植面積約464萬hm2，是世界半干旱地區居民蛋白質的主要來源[1]。在我國云南、廣西、海南、江西、貴州等南方省區均有栽培，現有面積約2萬hm2[2]。木豆葉片富含蛋白，是優質的蛋白飼料；木豆根系發達、固氮能力強，是理想的植被恢復和土壤改良樹種[3]。木豆藥用價值很高，有清熱解毒、治療水痘、瘧疾和股骨頭壞死等功效[4]。因此，木豆兼具生態、經濟和社會效益，開發利用前景很大，開展木豆種質資源多樣性分析具有重要的理論意義和經濟價值[5]。

種質資源是作物育種的基礎，開展種質資源的遺傳背景、遺傳多樣性及群體遺傳結構分析對作物遺傳育種和種質資源收集、保存鑒定具有重要的指導意義[6]。形態指標觀測及分析是作物種質資源遺傳多樣性研究最傳統、最直觀的方法，是早期育種家獲取作物種質資源間遺傳差異的重要途經。但作物形態指標觀測結果受環境影響大、穩定性差、周期長，嚴重影響了作物種質資源遺傳背景研究的進展和準確性[7]。隨著分子生物學技術的發展，AFLP，RAPD，SRAP等分子標記技術已經成為研究作物種質資源遺傳多樣性及群體遺傳結構的重要手段[8]。相對于AFLP，RAPD和SRAP標記，SSR標記具有數量豐富、多態性高、共顯性、實驗重復性好等多個優點，已在水稻(Oryzasativa)[9]、大豆(Glycinemax)[10]等多種作物種質資源的遺傳多樣性和群體遺傳結構分析上應用[11]。國外學者開展了大量的木豆種質資源收集、核心種質構建及遺傳多樣性評價[12-14]，但針對國內木豆種質資源的相關研究較少，僅見康智明等[15]、高桂娟和李志丹[16]通過形態性狀指標分別對10份和45份木豆種質進行了多樣性分析，閆龍等[17]和郭蓓等[18]分別利用AFLP和RAPD標記對木豆資源進行了多樣性分析。因此，為滿足國內木豆資源研究及創新利用的需求，有必要進一步開展木豆種質資源遺傳多樣性和群體遺傳結構分析。本研究利用已報道的SSR標記對72份木豆種質資源材料的遺傳多樣性和群體結構進行分析，從而為木豆資源收集、研究和育種工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用72份木豆種質資源以國內資源為主，均由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所草業研究室收集(表1)。所有供試種質資源均種植在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所牧草基地，每份材料種植10株，株間距1 m，行間距1 m，常規大田管理。

表1 供試木豆種質資源信息

1.2 DNA提取

在播種后田間生長40 d左右，采集木豆新鮮幼嫩葉片置于液氮中，保存在-80℃超低溫冰箱備用。參考周曉紅等[19]的方法，采用DNA提取試劑盒(OMEGA公司)提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品純度及質量，利用核酸蛋白含量測定儀測定DNA樣品濃度，并將其用無菌水稀釋到50 ng·μL-1保存于-20℃備用。

1.3 SSR引物來源和PCR擴增體系

從Bohra等[20]開發的木豆SSR標記中選取96對交由金斯瑞生物科技公司合成。選取形態差異較大的YD3，YD4，YN11，JX1，GD1和GX1 6份木豆種質材料對96對SSR標記進行篩選，篩選出多態性好、條帶清晰、主帶明顯的引物對72份供試材料進行PCR擴增及遺傳多樣性和群體遺傳結構分析。

PCR擴增體系采用20 μL反應體系，包括2×Es Taq MasterMix(Dye)10.0 μL，1.0 μL正向引物(10 μmol·L-1)，1.0 μL反向引物(10 μmol·L-1)，2.0 μL模板DNA(50 ng·μL-1)，剩余體積用ddH2O補足，PCR反應擴增程序為94℃預變性4 min；94℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環38次；最后72℃延伸5 min，4℃保存。擴增產物用3%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統保存圖片。

1.4 數據分析

以DL2000 DNA marker作為參考對擴增產物大小進行讀數，對清晰且明顯的條帶建立數據庫，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。所記錄的原始數據利用Excel軟件形成二進制矩陣，用于條帶多態性比較和聚類分析。利用NTSYS-ps2.10e軟件分析木豆種質資源的遺傳相似系數(Genetic similarity，GS)，然后利用GS值采用非加權組平均法(UPGMA)對供試材料進行聚類分析[21]。利用POPGENE1.32軟件計算SSR標記等位基因數(Number of alleles，Na)、等位基因頻率、觀察雜合度(Observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(Excepted heterozygosity，He)和Shannon多態性指數(Shannon index,I)等遺傳多樣性參數[22]。參考Botstein等[23]方法，根據等位基因頻率計算每個SSR標記的多態性信息含量(Polymorphic information content，PIC)。基于SSR數據利用Sturcture 2.3.4軟件[24]確定K值，并進一步計算每份木豆種質資源相應的Q值(歸入某一類群的概率)，對木豆種質資源進行群體遺傳結構分析，確定各種質資源的遺傳組成。

2 結果與分析

2.1 木豆種質資源間SSR擴增特點

選取形態差異較大的YD3，YD4，YN11，JX1，GD1和GX1 6份木豆種質資源對合成的96對SSR標記進行篩選，共篩選出42對在6份木豆種質資源中多態性好、條帶清晰、主帶明顯的SSR標記，其他標記中9對引物擴增條帶不夠清晰；7對引物擴增的主帶不夠明顯；38對引物擴增結果沒有多態性。

利用篩選出的42對SSR標記對72份木豆種質資源進行擴增及基因型分析發現，42對SSR標記在72份木豆種質中共檢測到118個等位基因，每個標記2～5個等位基因，平均2.8個(表2)。42對SSR標記的觀察雜合度的變化范圍為0.028～0.958，平均值為0.354；而期望雜合度的變化范圍為0.041～0.751，平均值為0.517，CcGM14962標記的觀察雜合度最高，CcGM14613預期雜合度最高。42對SSR標記的Shannon多樣性指數變化范圍為0.101～1.469，其平均值為0.844。多態信息含量值和Shannon多樣性指數都是CcGM14613最大，CcGM23321最小，表明CcGM14619具有較高的多態性檢測效率。

表2 42對SSR引物擴增結果

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1遺傳相似系數分析 基于42對SSR標記數據，利用NTSYS-pc 2.10e軟件對72份木豆種質資源進行遺傳多樣性分析。結果表明，供試材料間的遺傳相似系數介于0.440～0.915之間，平均值為0.643。其中YN1和YN2，HN7和YD7，GX15和HN14的遺傳相似系數最大(0.915)。而YN21與HN2遺傳相似系數最小(0.440)。不同材料之間的遺傳相似系數值大多分布在0.600～0.700之間，這部分比例占54.15%，相似系數小于0.500的占2.39%(圖1)。

圖1 72份木豆種質間遺傳相似系數

2.2.2聚類分析 根據不同種質間的遺傳相似系數和UPGMA法對72份木豆種質資源進行聚類分析(圖2)。在相似系數為0.566處將72份木豆種質分為3大類群：其中，第Ⅰ類包括69份種質材料，第Ⅱ類和第III類均為海南種質資源，分別包括2份種質(HN1和HN2)和1份種質(HN18)。相似系數在0.65處可將第I類分為6個亞類，其中第1亞類包含12份種質，云南4份、印度3份、廣西3份、廣東和海南各1份；第2亞類包含10份種質，云南6份、廣西2份、廣東和緬甸各1份；第3亞類包含21份種質，廣西6份、云南5份、海南5份、廣東、江西、緬甸、剛果和薩爾瓦多各1份；第4亞類包含12份種質資源，云南6份、廣西2份、安徽、廣東、海南和印度各1份；第5亞類包含10份種質，海南5份、廣西2份、廣東、云南和薩爾瓦多各1份；第6亞類包含4份國內種質，海南3份和廣東1份。

圖2 72份木豆種質資源的聚類分析

2.3 木豆種質資源的群體遺傳結構分析

為進一步明確供試資源的遺傳組成，根據SSR標記數據，使用Sturcture 2.3.4軟件對72份木豆種質資源進行遺傳結構分析。參照Evanno等[25]的方法，繪制ΔK隨K值增大的變化曲線，由圖所示，K=3時，ΔK值最大，即將72份木豆種質資源劃分為3個類群(圖3)。本研究參考劉麗華等[26]的研究，將Q≥0.600視為遺傳背景相對比較單一，Q<0.600視為具有混合來源。分析各木豆材料在不同類群中的Q值發現，72份木豆種質資源中57份種質的Q值≥0.600，遺傳背景比較單一，有15份木豆種質的Q值<0.600，遺傳背景較為復雜。在S1類群中包含26份木豆種質，各種質的Q值在0.413～0.984之間，22，23，24和36號種質的Q值在0.6以下，具有混合來源，其遺傳背景比較復雜，其中22，23和24號種質含有較多的S2背景；在S2類群中包含21份木豆種質，各種質的Q值在0.505～0.989之間，37，38，41，42和72號種質的Q值在0.6以下；在S3類群中包含25份木豆種質，各種質的Q值在0.480～0.991之間，其中6份種質的Q值在0.6以下，遺傳背景復雜(圖4、表3)。

圖3 K值曲線圖

圖4 基于SSR標記的72份木豆種質資源的群體遺傳結構(K=3)

表3 72份木豆材料的群體結構

3 討論與結論

SSR標記是研究作物種質資源遺傳多樣性及群體結構分析的重要工具[27]。本研究利用42對SSR標記對72份木豆種質資源進行遺傳多樣性及群體結構分析發現，平均每個SSR標記可檢測到2.8個等位基因，平均PIC值為0.442。這與Bohra等[20]和Odeny等[28]研究結果一致，但每個標記可檢測的等位基因數和PIC值均顯著低于Dutta等[29]研究結果，而顯著高于Sarkar等[30]的研究結果，這可能是由于不同研究中所選用的SSR標記和木豆種質不同引起的。本研究利用42對SSR標記分析供試木豆種質資源間的平均遺傳相似系數為0.643，并將72份木豆資源分為3類，說明木豆種質資源遺傳多樣性豐富，本文選用的42對SSR標記能夠有效揭示不同木豆資源間的遺傳差異。Njung′e等[31]利用48對SSR標記將79份‘馬拉維木豆’資源分成4個類群；Bohra等[20]利用217對多態性SSR標記通過聚類和群體結構分析，將94份木豆資源分成2個類群。說明SSR分析結果能夠很好地反映木豆種質資源間的親緣關系并對其群體結構進行有效劃分，但遺傳多樣性和聚類分析結果與標記的數量及供試材料的數量、來源及親緣關系都有關系[32]。

聚類分析與群體結構分析是探究作物種質資源遺傳多樣性和遺傳背景的有效手段，是作物種質資源保護和利用的前提[6]。本研究利用42對SSR標記對72份不同來源的木豆種質資源進行聚類分析和群體結構分析發現，72份木豆資源被分為3個大類，其中第I類可分為6個亞類，多數不同來源地的資源并沒有聚在一個大類或亞類中，如來自海南的18份木豆資源除了第I類的第2亞類外在其他類群中均有分布，說明本研究供試材料的聚類結果和地理來源并不完全一致，這與高桂娟和李志丹[33]對45份木豆種質資源的形態多樣性分析結果一致。在王秀芹和王洪剛[34]、李衛華等[35]對小麥種質資源及陳斐等[36]對苜蓿(Medicagosativalinn)種質資源的研究也發現種質資源的地理來源對遺傳差異有一定影響，但兩者并不存在必然聯系。這可能與現代不同地區種質資源交流頻繁及供試資源中許多為非野生資源有關。群體結構分析表明20.83%的木豆種質資源擁有混合來源(Q<0.6),遺傳背景復雜，從分子水平說明不同類群的木豆資源間存在較頻繁的基因交流，這可能與木豆常異花授粉特性有關[37]。

本研究利用42對多態性SSR引物對72份木豆種質資源進行了遺傳多樣性及群體結構分析。42對SSR引物在72份木豆種質資源中共檢測到等位基因118個。根據聚類分析將72份木豆資源分為3個大類，聚類結果和地理來源并不完全一致。群體結構分析發現79.17%的木豆種質資源遺傳背景比較單一，20.83%的資源擁有復雜的遺傳背景。本研究結果，不僅為育種者在利用這些育種材料時提供了有效的親緣關系信息，還提供了種質資源的遺傳結構復雜程度，為木豆雜交育種中雜交親本的選擇提供了重要參考。