黑枸杞多糖的提取及其對副干酪乳桿菌L9、嗜熱鏈球菌G2生長特性及抗氧化能力的影響

許英瑞,朱妍麗,薛元泰,張衛兵,楊曉麗,張炎,馬瑞娟,王瑩,文鵬程*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070) 2(甘肅省商業科技研究所有限公司,甘肅 蘭州,730000)

黑枸杞(LyciumruthenicumMurray)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)多棘刺灌木[1],主要分布于我國的甘肅、寧夏、新疆、內蒙古、西藏和陜北的黃土高原一帶,生長于鹽堿、干旱和沙漠地區[2]。在古代,黑枸杞就已被用于治療心臟病、更年期和月經不調等疾病[3],其果實含有豐富的生物活性物質[4],多糖作為黑枸杞果實最主要的活性成分之一,具有抗氧化[5]、抗輻射[6]、增強機體免疫[7]等能力。

目前國內外學者對黑枸杞多糖的研究主要集中于高效提取、結構特征和生物活性方面,熱水浸提是提取黑枸杞多糖最常用且較為簡單的方法,但是高溫和較長的提取時間會導致多糖降解[8]。超聲波能有效破壞細胞壁,增強細胞內容物的傳質能力,可以大幅縮短提取時間,提高提取率[9]。

黑枸杞因其多糖、花青素類物質含量較高而作為一種天然抗氧化物被廣泛應用于食品保鮮領域[10]。乳酸菌作為傳統發酵食品的主要發酵菌株,不僅能夠利用碳水化合物生成乳酸,還可以發酵糖類產生豐富的風味物質,在發酵食品中發揮著重要的作用[11]。

活性多糖可以作為促進乳酸菌生長或改善發酵乳抗氧化能力的添加劑[12-15],然而將多糖直接應用于乳酸菌本身以研究多糖對乳酸菌生長特性或抗氧化能力影響等方面卻鮮有報道。本文以野生黑枸杞為原料,采用單因素與響應面設計優化超聲波提取黑枸杞多糖的工藝條件；研究黑枸杞多糖對嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9的生長特性的影響以及多糖對2株乳酸菌抗氧化能力的影響,初步探索將黑枸杞多糖應用于發酵乳制品以及發酵食品的可行性,為開發更多的活性多糖食品打好堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞,采自甘肅民勤,均為野外生長,鮮果采摘經自然晾干后保存于4 ℃冰箱；副干酪乳桿菌L9、嗜熱鏈球菌G2,由甘肅農業大學食品科學與工程學院分離鑒定并保存；L9與G2的培養分別采用MRS固體培養基與GM17固體培養基,液體培養基同為MRS與GM17。

苯酚、濃硫酸、乙醇(95%)、正丁醇、三氯甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、鐵氰化鉀、抗壞血酸等,均為分析純。

1.2 儀器與設備

Scientz-ⅡD超聲細胞破碎儀、Scientz-ND真空冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司；723型可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠；TGL-20M高速臺式冷凍離心機、HG303-4電熱恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑枸杞的預處理

篩選表面無傷口且無腐爛的野生黑枸杞,放置于室外陽光充足處自然曬干,將曬干的黑枸杞干果粉碎并過篩網,保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 超聲波提取黑枸杞多糖的工藝優化

1.3.2.1 黑枸杞多糖浸提液的制備

稱量黑枸杞粉末2.00 g,加入一定量的蒸餾水攪拌均勻并進行超聲波提取。完成后離心(4 000 r/min,15 min)并抽濾,去沉淀留上清液,精確吸取上清液1 mL于100 mL容量瓶,定容后用于多糖含量的測定。

1.3.2.2 黑枸杞多糖含量的測定

采用硫酸-苯酚法[16],葡萄糖標準曲線為：y=11.429x-0.022 4,R2=0.993 2；多糖提取率按公式(1)計算：

(1)

式中：0.9,葡萄糖轉化為多糖的轉化因子；n,多糖浸提液稀釋倍數；ρ,多糖浸提液中糖濃度,g/L；V,提取液總體積,mL；m,所稱取黑枸杞粉末的質量,g。

1.3.2.3 單因素試驗

稱量黑枸杞粉末2.00 g,設定超聲波功率為250 W、超聲時間15 min,顆粒過篩目數為60目,選用不同液料比[20、30、40、50、60 (mL∶g)]探究液料比對黑枸杞多糖提取率的影響；設定液料比為上述單因素最佳、超聲功率為250 W、過篩目數為60目,選用不同提取時間(5、10、15、20、25 min)探究超聲時間對黑枸杞多糖提取率的影響；設定液料比和超聲時間為上述單因素試驗最佳、過篩目數為60目,探究不同超聲功率(50、150、250、350、450 W)對黑枸杞多糖提取率的影響；在液料比、超聲時間、超聲功率為最佳的基礎上,選用不同的篩網(20、40、60、80、100目)探究黑枸杞顆粒粒度大小對多糖提取率的影響。

1.3.2.4 響應面優化實驗設計

由圖1-d可知,當篩網孔徑<60目時,多糖提取率提升并不顯著,且篩網孔徑越小原料浪費越多,故選擇液料比(A)、超聲時間(B)、超聲功率(C)3個單因素進行響應面優化實驗,因素與水平設計見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experiment design

1.3.3 黑枸杞多糖凍干粉的制備

采用最優工藝制備黑枸杞多糖浸提液,將浸提液旋轉蒸發至原體積的1/4,加4倍體積的95%乙醇4 ℃醇沉24 h后離心得沉淀,沉淀用無水乙醇清洗(脫脂)3次,加純水復溶并使用Sevag試劑進行脫蛋白操作,將上清液保留并分裝于培養皿進行冷凍干燥后得黑枸杞粗多糖凍干粉,保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 乳酸菌的純化培養

無菌環境下,分別稱取L9與G2的凍干菌粉0.06 g于100 mL生理鹽水(0.85%)中復水30 min,以10倍梯度稀釋法取10-4～10-8五個濃度梯度涂平板,放于37 ℃恒溫培養箱培養48 h后挑取生長良好的單菌落劃線培養3代,經鏡檢確定為純種菌后保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.5 黑枸杞多糖對乳酸菌生長特性的影響

無菌環境下挑取預先純化的乳酸菌單菌落于液體培養基中活化培養3代,制得液體種子。將黑枸杞多糖按不同添加量[17](0、0.5、1、1.5 g/L)加入新鮮無菌的液體培養基加熱使其溶解并滅菌,待冷卻后按1%的接種量接入液體種子,放入37 ℃恒溫培養箱待測。

乳酸菌的生長曲線[18]采用比濁法繪制；產酸用pH計直接測定。

1.3.6 黑枸杞多糖對乳酸菌抗氧化能力的影響

1.3.6.1 乳酸菌菌懸液及無細胞提取物的制備

乳酸菌的活化培養同1.3.5。將黑枸杞多糖按不同的添加量(0.0、0.5、1.0、1.5 g/L)加入新鮮無菌的液體培養基,加熱使其溶解,滅菌后冷卻至37 ℃接入液體種子,放入恒溫培養箱培養24 h。

將培養完成的乳酸菌液體培養基離心(10 000 r/min,20 min)后獲得乳酸菌菌體,用PBS緩沖液(0.02 mol/L,pH=7.4)洗滌2次以除去殘留的培養基成分與多糖成分,將乳酸菌菌體重懸于PBS緩沖液中并調節菌液濃度為1.0×109CFU/mL(OD600=1.0)；共設置2組菌懸液,一組為完整細胞組(intact cells,IC),另一組進行超聲細胞破碎處理(300 W,20 min；開5 s,關5 s)后離心(10 000 r/min,20 min)取上清液作為無細胞提取物(cell free extracts,CFE)。

1.3.6.2 抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參考RIZZELLO等[19]的方法,總還原力的測定參考WU等[20]的方法。

1.4 數據處理與統計分析

試驗所做平行次數均為3次,取平均值進行數據分析；采用Excel進行數據統計,Origin 2018繪圖,SPSS 22.0數據分析,Design-Expert.V 8.0.6.1進行響應面實驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

圖1呈現了液料比、超聲時間、超聲功率、篩網孔徑大小的單因素試驗結果。分析黑枸杞多糖的提取率隨各個單因素不同水平的變化規律并綜合考慮實際操作與節能等原因,選擇液料比為40(mL:g)、超聲15 min、超聲波功率為350 W作為最佳條件,并在液料比30～50(mL:g)、超聲10～20 min、超聲波功率250～450 W進行中心復合試驗。

a-料液比；b-超聲波時間；c-超聲波功率；d-過篩目數圖1 單因素試驗結果Fig.1 Single factor experiment results 注：圖中不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 響應面優化實驗結果

2.2.1 響應面優化設計

本次優化實驗共17組,每組實驗重復3次,試驗設計和結果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

續表2

2.2.2 回歸模型分析

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

模型中1次項A、B、C,2次項A2、B2、C2對多糖的提取率影響高度顯著(P<0.01)；交互項AB、AC、BC對多糖的提取率影響不顯著；方差分析結果表明,影響黑枸杞多糖提取率的因素主次順序為：超聲功率>超聲時間>液料比。

2.2.3 響應面作用交互分析

由圖2可知,各個交互項之間均呈現不同的彎曲程度,其中圖2-a的響應曲面圖相對較陡,故因素B和A交互效應最大,該結果與方差分析結果一致。

a-提取時間與液料比；b-提取功率與液料比；c-提取功率與提取時間圖2 各因素交互作用對黑枸杞多糖提取率的影響Fig.2 Effect of interaction of various factors on extraction rate of L.ruthenicum Murray polysaccharide

2.2.4 超聲波提取黑枸杞多糖最佳工藝參數確定

通過模型預測得到黑枸杞多糖的最佳提取條件為：液料比41.46(mL∶g),提取15.78 min,提取功率416.66 W,黑枸杞多糖的提取理論值為14.106%。依據最佳條件并考慮實際操作將其做出調整：液料比41.5(mL∶g),超聲16 min,超聲波功率418 W。以該實際提取條件為基礎進行3次重復驗證試驗,得到黑枸杞多糖的實際提取率為(14.13±0.74)%,與預測值相差不大,說明此提取條件適用于黑枸杞多糖提取工藝的優化。將得到的黑枸杞多糖凍干粉加三級水復溶,溶解后采用硫酸-苯酚法測得其多糖含量為65%。

2.3 黑枸杞多糖對G2、L9生長特性的影響

圖3-a顯示了黑枸杞多糖對嗜熱鏈球菌G2生長特性的影響。結果表明,隨著培養時間的延長,黑枸杞多糖不僅縮短了G2的生長停滯期使其提前進入對數生長期,而且加快了乳酸菌的增殖速度,整個生長過程多糖組生物量始終高于對照組；由產酸曲線可知,黑枸杞多糖能夠加速體系pH下降速度。不同多糖添加量處理中,0.5 g/L多糖組不僅獲得了最大的乳酸菌生物量,同時pH下降速度也最快,表明0.5 g/L的黑枸杞多糖對嗜熱鏈球菌G2的促生長效果明顯。

a-嗜熱鏈球菌G2；b-副干酪乳桿菌L9圖3 黑枸杞多糖對乳酸菌生長特性的影響Fig.3 Effect of L.ruthenicum Murray polysaccharides on the growth characteristics of lactic acid bacteria

圖3-b反映了黑枸杞多糖對副干酪乳桿菌L9生長特性的影響。添加黑枸杞多糖的培養過程中,L9的生長沒有出現明顯的停滯期,能較快適應生長環境,進入對數生長期；培養過程中,黑枸杞多糖延長了L9的對數生長期,并加快了乳酸菌的增殖速度。產酸曲線顯示,不同多糖添加水平,其pH下降速度與對照組幾乎保持一致,說明黑枸杞多糖對L9產酸影響較弱,這可能是由于L9前期產酸較多、產酸速率較快導致乳酸菌的生長環境受到限制,無法從多糖及其他成分中吸收營養物質進行代謝,使乳酸菌的生長受到了抑制；不同多糖含量對L9的促生長效果影響微弱,且各多糖組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 黑枸杞多糖對G2、L9抗氧化能力的影響

2.4.1 黑枸杞多糖對G2、L9 DPPH自由基清除能力的影響

由圖4-a可知,黑枸杞多糖對嗜熱鏈球菌G2清除DPPH自由基的能力影響顯著。G2本身清除自由基的能力較弱,G2的菌懸液(IC-G2)清除自由基的能力稍強于G2的無細胞提取物(CFE-G2)；將黑枸杞多糖應用于G2生長環境,發現IC-G2與CFE-G2清除自由基的能力均顯著提升(P<0.05),且清除效果隨多糖添加量的增加而顯著提高(P<0.05)；其中,1.5 g/L的多糖組其IC-G2與CFE-G2均獲得了最高的自由基清除率,這可能是由于黑枸杞多糖同時促進了G2胞內與胞外抗氧化物質的生成,從而提高清除DPPH自由基的能力。由圖4-c可知,黑枸杞多糖對副干酪乳桿菌L9清除DPPH自由基的能力無顯著提升效果。對比不同處理組,發現黑枸杞多糖對L9的菌懸液(IC-L9)清除自由基的能力影響并不顯著(P>0.05),只有微弱的提升效果；對L9的無細胞提取物(CFE-L9)清除自由基的能力影響顯著(P<0.05),但依賴較高的劑量關系,且各多糖組之間并無顯著差異。對比IC-L9與CFE-L9清除DPPH自由基的能力,發現IC-L9自由基清除率明顯高于CFE-L9,初步證明L9清除自由基的能力主要依靠胞內抗氧化物質。

a-嗜熱鏈球菌G2；b-副干酪乳桿菌L9圖4 黑枸杞多糖對乳酸菌DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of L.ruthenicum Murray polysaccharide on DPPH free radical scavenging ability of lactic acid bacteria 注：完整細胞組(IC)的差異顯著用a的形式表示,無細胞提取物 組(CFE)的差異顯著用a’的形式表示(P<0.05)(下同)

2.4.2 黑枸杞多糖對乳酸菌還原力的影響

研究了黑枸杞多糖對此2株乳酸菌(嗜熱鏈球菌G2和副干酪乳桿菌L9)的還原力的影響。由圖5-b與圖5-c可知,黑枸杞多糖對G2與L9還原力的影響效果都較為顯著(P<0.05),IC-G2、CFE-G2與IC-L9、CFE-L9的還原力強度隨黑枸杞多糖添加量的增大而提高；通過對比IC與CF兩組數據間的差異,發現G2與L9其IC的還原力都強于CFE,且1.5 g/L的多糖組都獲得了最高的還原力。

a-嗜熱鏈球菌G2；b-副干酪乳桿菌L9圖5 黑枸杞多糖對乳酸菌還原力的影響Fig.5 Effect of L.ruthenicum Murray polysaccharide on the reducing power of lactic acid bacteria

3 討 論

本試驗基于超聲波法提取黑枸杞多糖,得到多糖的實際提取率為(14.13±0.74)%,在同為超聲波法提取黑枸杞多糖的前提下,前人通過工藝優化得出的提取率分別可以達到7.01%[21]、8.25%[5],本工藝在僅提取1次的條件下多糖提取率可達14.13%,與前人所得的多糖提取率相比,得到大幅提高。

黑枸杞多糖對乳酸菌生長特性影響的試驗結果表明,添加量為0.5 g/L的多糖組對G2的促生長作用表現最佳,但多糖含量對L9的促生長效果影響微弱。孟鴿等[22]將霍山石斛多糖加入嗜酸乳桿菌的生長環境中,發現添加6 g/L霍山石斛多糖能夠顯著提升其生物量,表現出最佳的促生長作用。劉麗莎等[23]發現,隨著白術多糖添加量的增大,植物乳桿菌的促生長作用顯著增強并在2.0%時達飽和；但對嗜酸乳桿菌而言,白術多糖對其促生長作用僅在1.0%的范圍內隨多糖添加量增加而增強,且促生長效果明顯低于對植物乳桿菌的促生長效果。這表明多糖能夠影響乳酸菌生長的因素較多,機理較為復雜。

乳酸菌的抗氧化試驗結果顯示,G2與L9本身抗氧化性能較弱,2個菌株均不屬于高抗氧化菌種。本研究將黑枸杞多糖作用于乳酸菌生長環境,得出隨著黑枸杞多糖添加量的增加,完整細胞懸液與無細胞提取物的抗氧化能力也逐漸上升,且1.5 g/L的多糖組對乳酸菌的抗氧化能力促進效果最好。結果表明,通過黑枸杞多糖的添加,成功改善了菌株的抗氧化能力；同時,王婧瑩[24]等研究發現0.1%～0.3%的NaCl能提高保加利亞乳桿菌的體外抗氧化能力,且0.2% NaCl抗氧活性最好,但是否為NaCl促進了菌種抗氧化物質的產生還有待驗證。

4 結論

本研究通過單因素與響應面設計獲得了黑枸杞多糖的最佳提取條件,得到一種簡便且高效的黑枸杞多糖超聲提取方法,大幅縮短了黑枸杞多糖的提取時間并相對提高了多糖提取率。黑枸杞多糖不僅能夠促進嗜熱鏈球菌G2的增殖并加快其降酸速度,而且延長了副干酪乳桿菌L9的對數生長期；其中0.5 g/L多糖對G2的促生長作用強,但對L9促生長效果影響不明顯；同時,隨著黑枸杞多糖添加量的增加,G2與L9的抗氧化性能均有所提升,其中1.5 g/L多糖組抗氧化性能最強。黑枸杞多糖對2株乳酸菌生長起到促進作用,并且能夠有效提升其抗氧化能力,本研究為今后有效發揮乳酸菌菌株的作用、開發功能性發酵食品提供理論基礎和科學依據。