超濾分離制備玉米須粗多糖及其促益生菌增殖活性研究

宮春宇,徐碩,徐先梅,劉羽婷

1(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院,黑龍江 齊齊哈爾,161006)2(黑龍江省果蔬雜糧飲品 工程技術研究中心,黑龍江 齊齊哈爾,161006) 3(齊齊哈爾大學 通信與電子工程學院,黑龍江 齊齊哈爾,161006)

玉米須是一種藥食兩用的傳統中藥材[1],資源豐富,生理功能廣泛。玉米須多糖是其最重要的功能成分之一,但目前開發利用非常有限,因此有關玉米須多糖的研究成為近年來的熱點。通常采用熱水浸提后乙醇沉淀的方法制備大分子多糖,但此法需要消耗大量乙醇,工藝控制也較復雜,而超濾法是利用膜過濾的物理方法分離獲得大分子物質,具有操作簡單、無試劑消耗、無相變等優點,應用越來越廣泛[2-4]。目前因多糖純化比較復雜且得率較低,有關多糖的開發多以粗多糖為目標物,而關于采用超濾法制備的玉米須粗多糖的性質和功能少有報道。本課題組報道過超濾制備玉米須粗多糖的工藝,并分析了其簡單成分組成[5],并發現其可以正向調節小鼠體內免疫功能[6]。因此本研究較系統地分析了超濾法制備的玉米粗多糖的性質,重點分析了該糖的礦物質組成、單糖組成和多糖的表面結構,并研究了該粗多糖促進酸奶中益生菌增殖活性,以期為玉米須多糖的開發利用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

玉米須,安徽亳州中藥材批發市場,經清洗、烘干、粉碎備用。無菌磚純牛奶、益消牌原味發酵乳，伊利乳業。

1.1.2 主要試劑

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one,PMP)、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸標準品,Sigma公司；苯酚、濃硫酸、甲醇、氯仿等試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器

UF-20中空纖維超濾裝置,大城縣華泰凈化技術有限公司；722 N可見分光光度計,上海箐華科技儀器有限公司；PYX-DHS-500BS隔水電熱培養箱,北京市永光明醫療儀器廠；S—4300掃描電子顯微鏡,日本Hitachi公司；傅里葉-紅外色譜儀,美國PE公司；高效液相色譜,美國Agilent公司；NexION350X電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma massspectrometry,ICP-MS),美國PerkinElmer公司；756 PC紫外可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米須多糖超濾制備

玉米須粉熱水煮沸2 h,3 000 r/min離心分離上清液,玉米須殘渣同法再提取1次,合并2次提取上清液,經截留分子質量為10 kDa超濾膜超濾分離的小分子物質,收集超濾濃縮液,進一步濃縮后烘干至質量恒定,獲得玉米須超濾粗多糖,保存于干燥器中備用。

1.2.2 玉米須多糖成分分析

多糖測定采用苯酚-硫酸法[7]；蛋白質測定采用凱氏定氮法[8]；總黃酮測定采用AlCl3分光光度法[9];總酚測定采用福林酚法[10]；脂肪測定采用索氏提取法[11]；灰分含量測定采用坩堝法[12]。

1.2.3 玉米須多糖單糖組成分析

(1)單糖標準品的PMP衍生化：用0.3 mol/L的NaOH溶液分別配制濃度為10 mmol/L的鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖糖醛酸標準品,取0.5 mL等體積混合溶液加入0.5 mL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液,密封后渦旋30 s,于70 ℃水浴反應30 min,冷卻后加入0.5 mL 0.3 mol/L的HCl溶液渦旋30 s以中和溶液。加入3 mL氯仿萃取,渦旋3 min后離心,收集上清液,同法反復萃取3次,上清液適當稀釋,膜過濾后,進行高效液相分析。

(2)多糖樣品水解及PMP衍生化：分別稱取20 mg多糖樣品于安瓿管中,加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸,封管120 ℃水解4 h后吹干,再加入2 mL甲醇吹干,重復加甲醇約3次以除盡三氟乙酸。加入2 mL 0.3 mol/L NaOH溶液溶解,取0.5 mL溶液按(1)進行PMP衍生化。

(3)液相色譜條件：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm),PAD檢測器,檢測波長254 nm,柱溫30 ℃,流動相為100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.7)∶乙腈=83∶17(體積比),流速1.0 mL/min,進樣量20 μL。

1.2.4 玉米須多糖礦物質元素ICP-MS分析

(1)微波消解

準確稱量0.200 g的樣品于消解罐中,再加入1 mL濃硝酸,3 mL濃鹽酸,1 mL H2O2,上罐后按確定的消解條件進行微波消解,同時做空白對照。將消解液轉移到100 mL塑料容量瓶中,用體積分數3%的HNO3溶液定容至100 mL備用。消解條件：當消解儀升溫至100 ℃時,保持2 min；140 ℃時,保持2 min；170 ℃時,保持2 min；200 ℃時,保持5 min；220 ℃時,保持10 min；MAX,235 ℃。

(2)ICP-MS工作參數

霧化氣流量0.99 L/min；輔助氣流量1.2 L/min；等離子氣流量18 L/min；ICP射頻功率1 600 W；模擬階段電壓-1 650 V；脈沖電壓800 V；檢測器電壓12 V；偏轉板電壓-12 V；模式：KED,3 mL/min。

1.2.5 玉米須多糖微觀結構分析

取適量玉米須多糖干樣品,黏著于附有銅膠帶的樣品臺上,置于離子濺射儀中鍍上一層導電金粉,然后將其安放在掃描電鏡下觀察。工作條件：加速電壓20 kV。

1.2.6 紫外掃描分析

稱取多糖樣品,用蒸餾水配制成0.25 mg/mL的溶液,在200～600 nm下進行紫外-可見光掃描。

1.2.7 紅外掃描分析

取干燥玉米須多糖樣品10 mg,與KBr 100 mg進行充分混合,經瑪瑙研缽充分研磨后壓片進行紅外光譜掃描,掃描波數為4 000～400 cm-1。

1.2.8 促進酸奶中益生菌增殖活性研究[13]

在無菌室中采用無菌操作將原料乳(純牛奶)加入無菌燒杯中(100 mL/杯),加入不同質量的玉米須多糖,另設空白對照組,每實驗設置3次重復,接入含有混合益生菌種(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌的混合菌種,活菌總數為1×106CFU/mL)的原味發酵乳,接種量16.7%,封口后45 ℃培養8 h,檢測益生菌增殖情況。

乳酸菌檢測依據GB 4789.35—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》方法進行。選2～3個連續的適宜稀釋度,每個稀釋度取0.1 mL樣品,分別置于3個MRS瓊脂平板,使用涂布棒進行表面涂布。(36±1)℃,培養(48±2) h后計數平板上的所有菌落數。

2 結果與分析

2.1 玉米須粗多糖成分

超濾法制備的玉米須粗多糖主要是由2種含量相當的大分子物質多糖和蛋白質組成,其中多糖含量35.43%、蛋白質含量34.51%,兩者占粗多糖的近70%,課題組前期研究顯示，玉米須粗多糖熱水總浸提物提取率為8.37%，而超濾可分離除去熱水總浸提物33.75%的組分[5],表明超濾法可以有效制備大分子物質多糖,但同醇沉制備法一樣,也會產生大量大分子蛋白質。超濾多糖中還含有4.78%灰分,少量的總黃酮和總酚,基本不含脂肪。

2.2 礦物質元素分析

礦物質元素是人體重要的營養素之一,參與許多重要的生理功能。同時,礦物質元素會與許多大分子物質結合,參與這些大分子物質的結構組成和功能發揮。分析顯示玉米須粗多糖,除主要由大分子多糖和蛋白質等組成,還含有大量灰分,但目前有關其組成中礦物質元素的分布情況未見報道。采用ICP-MS分析發現(表1),玉米須超濾粗多糖中富含K、Mg、P、Fe和Ca元素,除Ca 含量134.60 mg/100 g和Fe含量185.81 mg/100 g外,其他3種元素均超過200 mg/100 g,其中K含量尤其高,達到1 196.90 mg/100 g,超過其他元素總量之和。粗多糖中Na和Zn含量較低,只有43.40和50.40 mg/100 g,Al含量最低僅為21.23 mg/100 g。玉米須富含K元素,K具有利尿功效,現證實通過超濾制備的玉米須粗多糖也含有大量K元素,這可能是玉米須多糖的一個重要特征,推測其可能會結合到多糖的糖鏈上,直接影響玉米須多糖的結構和功能,相關研究可重點關注。

表1 玉米須超濾粗多糖主要礦物質含量Table 1 Main mineral content of corn silk ultrafiltration crude polysaccharide

2.3 紫外分析

使用紫外-可見分光光度計對玉米須粗多糖進行光譜掃描。由圖1可知,在260～280 nm 處出現明顯的吸收峰,說明有蛋白質存在,與化學分析結果一致,而在350～550 nm 波長內,沒有發現類胡蘿卜素的特征吸收峰[14]。

圖1 玉米須粗多糖的紫外-可見光掃描譜圖Fig.1 UV-Vis scanning spectrum of polysaccharide from Stigma maydis

2.4 紅外分析

圖2 玉米須粗多糖的紅外掃描譜圖Fig.2 Infrared scanning spectrum of polysaccharide from Stigma maydis

2.5 單糖組成

玉米須超濾粗多糖先后經離子層析和凝膠層析分離后,采用三氟乙酸水解和單糖衍生化,再進行高效液相色譜層析,根據與標準單糖保留時間進行對比,分析多糖組分的單糖構成。通過高效液相色譜分析發現,一種酸性玉米須多糖組分主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成,其摩爾比約為1∶0.31∶0.32∶1.39∶3.06∶0.60,不含半乳糖醛酸和木糖,如表3所示。在保留時間為11.58和19.05 min出現2個未知峰,表明該多糖中可能還含有2個未知的單糖,其中保留時間為19.05 min組分的峰面積比較小,表明其含量可能比較低。可見,該酸性多糖組成單糖中半乳糖、葡萄糖和甘露糖含量很高,3種單糖含量之和約為所有已知單糖組分總和的80%以上,其中半乳糖含量最高,約為所有已知單糖組分總和的45%以上。另外,高效液相色譜分析發現鼠李糖是玉米須多糖的組成單糖之一,與紅外分析相一致。報道顯示,在玉米須多糖中發現有甘露糖[15-18]、鼠李糖[16-17]、葡萄糖[17-18]、半乳糖[15,17-18]和阿拉伯糖[15-18]的存在,與本研究結果一致。本研究中未發現有木糖,但有學者報道玉米須中有木糖的存在[15,17-18],還有報道稱玉米須多糖組成單糖中有來蘇糖[18]和果糖[15],而本研究中發現2個未知單糖峰,在后續研究中可進一步驗證。賈亞敏等[17]研究顯示半乳糖和葡萄糖這2種單糖的含量比較高,與本研究結果一致；而關于甘露糖含量的報道不一致,本研究中發現其含量也較高,但也有其含量很低的報道[17]。現有報道中未見有關糖醛酸的存在,本研究中發現在玉米須酸性多糖中含有葡萄糖醛酸,但其含量相對較低,不含有半乳糖醛酸。

表2 高效液相色譜分析中單糖出峰時間和濃度Table 2 Peak time and concentration of monosaccharide in HPLC

2.6 電鏡掃描分析

玉米須多糖在掃描電鏡下,呈現出邊緣帶分枝的片狀結構和大小不均的桿柱狀形態。放大100倍時(圖3-a),該多糖呈現出不規則片狀和桿柱狀形態,片狀結構為主體,且大小不一,片狀邊緣有分枝,這可能與該多糖凍干后成非常輕薄的絮層狀有關。多糖的分枝結構在枸杞多糖[19]和銀合歡種子多糖[20]中也有發現。放大至150倍(圖3-b),多糖表面形貌平整光滑,清晰可見片狀結構通過許多分枝連接,有一些細分枝成桿柱狀,可以延伸很長。放大到700倍(圖3-c)和1 000倍(圖3-d),桿柱狀分枝和片狀結構的表面非常光滑、平整,片狀結構上裂口呈現不規則鋸齒狀。在10 000倍視野中(圖3-e),可見多糖為連續的膜狀結構,表面略微凹凸不平。與此相似,在高倍鏡下,虎奶菇菌核多糖[21]、豌豆水溶性粗多糖[22]、枸杞多糖[19]表面也為平整、致密的平面結構。但豌豆多糖經離子和凝膠層析獲得的幾個組分,在10 000倍時,其結構為致密的圓球顆粒[22];銀合歡種子多糖[20]經純化后也為致密的球狀,與玉米須多糖有明顯差異。另外也有多糖具有不同表面形態的報道,金針菇根部多糖呈現絮狀結構[23]、防風多糖呈現出不規則的纖維絲狀與顆粒狀的堆積[24]、虎奶菇菌核多糖聚集體SHNP呈成屑狀、片狀和桿柱狀[21]。可見,不同種類的多糖在電鏡掃描分析中表現出的表面形態并不一致。綜合分析,粗多糖因通常混有大量的蛋白質等大分子物質,其表面結構通常可能是連續的,且比較光滑,而經過一定純化后,不同種類多糖的微觀結構可能會有不同表現,有的是連續的平面結構,有的是致密的球狀等。這可能和多糖的單糖組成和高級結構有直接關系。

a-×100;b-×150;c-×700;d-×1 000;e-×10 000圖3 玉米須中性多糖掃描電鏡照片Fig.3 Scanning electron microscope images of neutral polysaccharide from Stigma maydis

2.7 玉米須粗多糖促進酸奶中益生菌增殖作用

在前期研究中發現采用超聲波提取、乙醇沉淀獲得的玉米須粗多糖可以促進酸奶中乳酸菌總數和嗜熱鏈球菌的增長[16]。本研究分析了采用超濾法分離的玉米須粗多糖對酸奶中益生菌促生長作用的影響。由圖4可見,超濾法制備的玉米須粗多糖可以促進酸奶中乳酸菌增殖,且呈現劑量依賴。通過2種不同方法制備的玉米須粗多糖的活性表現一致,可見玉米須粗多糖確實具有促進益生菌增殖的作用,具備后續開發潛力。

圖4 玉米須超濾粗多糖對乳酸菌菌落總數的影響Fig.4 Effect of addition crude polysaccharide from S.maydis into yogurt making on lactic acid bacteria count

3 結論

超濾法分離制備玉米須粗多糖主要含有35.43%多糖、34.51%蛋白質、4.78%灰分,還有少量的總黃酮和總酚,基本不含脂肪；經ICP-MS分析,該多糖中富含K、Mg、P、Fe和Ca元素,除Ca 含量134.60 mg/100 g和Fe含量185.81 mg/100 g外,其他3種元素均超過200 mg/100 g,其中K含量尤其高,達到1 196.90 mg/100 g,超過其他元素總量之和,Na和Zn含量較低,只有43.40和50.40 mg/100 g,Al含量最低僅為21.23 mg/100 g；高效液相色譜分析發現一種酸性玉米須多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成,其摩爾比約為1∶0.31∶0.32∶1.39∶3.06∶0.60,不含有半乳糖醛酸和木糖,還可能含有2個未知的單糖,可見甘露糖、葡萄糖和半乳糖是該多糖的主要單糖,含量逐漸升高；掃描電鏡顯示,玉米須多糖呈現為邊緣帶分枝的片狀結構和大小不均的桿柱狀,其中片狀結構為主體,且大小不一,片狀邊緣有分枝,表面結構非常光滑、平整；紅外分析發現其具有多糖的典型吸收峰；添加超濾分離制備的玉米須粗多糖制作酸奶,發現其可以促進酸奶中乳酸菌增殖,表現出劑量依賴性。