蝦肽對過氧化氫誘導RAW 264.7細胞氧化損傷的保護作用

邵婉,王芮,周宇芳,相興偉,,孫繼鵬,王家星,廖妙飛,鄧尚貴,鄭斌*

1(浙江海洋大學 食品與醫藥學院,浙江 舟山,316021) 2(浙江省海洋開發研究院,浙江 舟山,316021) 3(浙江工業大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014)

氧化應激是由于生物系統中自由基的增加而發生的。在正常情況下,需氧生物通過組織良好的酶和非酶的自我防御系統來維持細胞穩態[1]。然而,由于自由基的過度表達,機體的抗氧化能力降低,細胞分子受損,最終導致多種疾病的發生[2]。對細胞系統造成嚴重損害的自由基大部分是氧自由基,通常稱為活性氧(reactive oxygen species,ROS)。它們的普遍存在源自不平衡的氧穩態,導致細胞內氧化應激的產生[3]。H2O2是造成氧化損傷的主要因素之一,它與誘導內源性氧化應激有關,從而導致細胞的致癌、突變和細胞毒性[4]。

近年來,研究發現巨噬細胞是研究抗氧化的合適模型。有研究表明,一些細菌的毒性是由于它們能夠通過刺激ROS的產生觸發活化巨噬細胞的死亡[5]。過量的ROS很容易轉化為H2O2,并通過血紅素催化的Fenton反應生成活性高、毒性強的·OH,最終導致巨噬細胞死亡[6-7]。巨噬細胞參與宿主防御,是促氧化劑作用的主要靶點,在識別和清除微生物病原體的宿主防御系統中起著至關重要的作用[7]。鑒于巨噬細胞在免疫系統中的重要性及其易受ROS影響,利用巨噬細胞作為藥物篩選模型可以為研究天然產物在免疫系統中的抗氧化作用提供直觀的科學平臺。H2O2通常用于研究巨噬細胞凋亡或氧化應激介導的細胞損傷[8]。當機體受到氧化應激時,抗氧化劑可以延緩細胞損傷程度。目前,天然高效抗氧化劑的開發與應用受到越來越多的科研人員的關注。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦肽(peptides fromSolenoceracrassicornisby-products，SCBP)，實驗室自行制備，原料為舟山市越洋食品有限公司提供的紅蝦加工副產物蝦頭蝦殼，分子質量：250～1 000 Da，蛋白質量分數：61%。

小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7，中國科學院上海細胞庫；高糖杜爾伯科改良依格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)、澳洲胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、雙抗，美國Gibco公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒，南京建成生物工程研究所；反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)試劑，TaKaRa公司； H2O2，美國Sigma；TRIzol試劑、CCK-8試劑盒、核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)抗體、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch like-ECH-associated protein 1，Keap1)抗體，上海碧云天生物有限公司。其他試劑均為國藥試劑分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平(BP211D),美國Sartorius公司；pH計(PHS-3S),上海虹益儀器儀表有限公司；全自動酶標儀(Multiskan FC),美國Thermo Scientific科技有限公司；超純水儀(AdvantageA10),美國Milli-Qplus公司；超低溫冰箱(902-ULTS),美國Thermo Scientific科技有限公司；低溫高速離心機(TG20-WS),長沙湘智離心機儀器有限公司；核酸蛋白定量儀(ND-2000),美國Nanodrop公司；PCR儀(My Cycler),美國Bio-Rad公司；ABI 實時熒光定量PCR儀(ViiATM7),美國Applied Biosystems公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蝦肽的制備

按料液比1∶10(g∶mL)向紅蝦原料中加入95%乙醇混合,室溫下攪拌脫脂8 h,過濾,取濾渣,45 ℃烘干,備用。按料液比1∶2(g∶mL)向濾渣中加入蒸餾水,pH調至7.2,加入質量分數2%堿性蛋白酶,于55 ℃下攪拌酶解5 h,90 ℃滅酶20 min,過濾取上清液。將酶解液進行 0.5 μm 孔徑無機陶瓷膜分離。收集透過液依次通過1 000和 250 Da的超濾膜,收集透過液和截留液,得到250～1 000 Da組分,冷凍干燥,即得蝦肽。

1.3.2 試驗細胞培養及處理

RAW 264.7用體積分數10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養液于37 ℃在體積分數5%CO2細胞培養箱中傳代培養。取指數生長期的RAW 264.7細胞用于實驗,預熱PBS洗3次,反復輕柔吹打,收集細胞,細胞計數板計數,根據實驗需要調整細胞濃度進行種板,用于實驗。

1.3.3 CCK-8法測定細胞毒性

收集細胞,制成適宜濃度的細胞懸液,通過細胞計數板在顯微鏡下計數,而后用完全培養基稀釋到濃度為4×103/mL接種至96孔板,每孔100 μL,置于5%CO2、37 ℃孵箱中培養12 h；待細胞充分貼壁后,分組加入不同濃度的藥物,每組設置3～6個復孔,同時設置空白組(不加藥物),培養24 h后,避光每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育1～4 h,待空白對照組達到橙黃色時結束,用酶標儀測定450 nm處的OD值。細胞存活率按公式(1)計算：

細胞的存活率/%=實驗組OD值/空白組OD值×100

(1)

1.3.4 蝦肽對H2O2損傷的RAW 264.7活力的影響

用不同質量濃度的SCBP(200、400和600 μg/mL)預處理RAW 264.7細胞24 h,溫熱的PBS洗3次。除對照組外,其他組的細胞加入包含500 μmol/L H2O2的DMEM培養基中12 h,然后每孔加入CCK-8 10 μL,繼續培養4 h后,用酶標儀測定450 nm處各孔的OD值。

1.3.5 氧化因子測定

6孔板接種對數生長期RAW 264.7細胞密度為2.5×104/mL,孵育24 h。去培養基,加入含有不同濃度SCBP的培養基孵育24 h,然后更換至500 μmol/L H2O2處理12 h。收集培養基上清液測定SOD,CAT和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)的含量。

1.3.6 細胞因子 mRNA 表達水平的測定

6孔板接種對數生長期RAW 264.7細胞密度為2.5×104/mL,孵育24 h。去培養基,加入含有不同濃度SCBP的培養基孵育24 h,然后更換至500 μmol/L H2O2處理12 h。用1 mL PBS吹打下細胞,PBS洗3遍后轉移至無RNA酶的EP管中,加入1 mL預冷的TRIzol試劑,反復吹打裂解細胞,根據GenBank基因序列,用Primer Premier 5.0設計相應特異性引物,并由上海生物工程公司合成,按TRIzol試劑法提取細胞總RNA。用核酸蛋白定量儀檢測A260/A280、A260/A230及RNA濃度,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的純度。檢測后的總RNA根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。按照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒說明書配制反應體系,進行PCR反應。熒光的采集與溶解曲線的制作按照實時熒光定量PCR儀的說明進行。每個樣品靶基因的相對mRNA表達水平用2-ΔΔCt計算,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因為內參。

1.3.7 Western Blotting法檢測Nrf2、Keap1蛋白表達

6孔板接種對數生長期 RAW 264.7 細胞2.5×104細胞/孔,孵育24 h。去培養基,加入含有不同濃度SCBP的培養基孵育24 h,然后更換至500 μmol/L H2O2處理12 h。用1 mL PBS吹打下細胞,收集細胞于1.5 mL EP管中,每管加入RIPA裂解液40 μL,吹打數次,置冰上裂解15 min。12 000 r/min、4 ℃,離心10 min,取上清液,按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白濃度測定。調整蛋白至相同濃度按比例加入蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min,12 000 r/min、4 ℃,高速離心2 min,取上清液進行SDS-PAGE電泳及轉膜。轉膜后,用脫脂乳粉配制質量分數5%的復原乳封閉1 h,4 ℃下分別孵育Nrf2、Keap1一抗過夜,再與HRP-二抗室溫孵育2 h。使用碧云天BeyoECL Star(特超敏ECL化學發光試劑盒)顯影,將膜置于顯影液中,使用化學發光成像儀,觀察條帶,并拍照分析。

1.4 統計與分析

數據應用GraphPad Prism 10.01軟件進行統計學分析,數據均用平均值±標準差表示,采用單因素方差(One-way ANOVA)多重比較進行差異顯著性檢驗,P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 SCBP對RAW 264.7細胞活力的影響

為了評估SCBP對RAW 264.7細胞增殖活力的影響,使用不同濃度的SCBP對細胞進行處理,并采用CCK-8法測定細胞的存活率。由圖1可知,ρ(SCBP)<600 μg/mL時對RAW 264.7細胞的存活率沒有影響(P>0.05),說明其對RAW 264.7細胞的代謝生長無明顯的毒性,但超過該濃度會降低細胞存活率(P>0.05)。因此,SCBP質量濃度選擇200、400和600 μg/mL進行后續實驗。

圖1 SCBP質量濃度對RAW 264.7細胞活力的影響Fig.1 Effect of SCBP on the viability of RAW 264.7 cells 注：組間不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2 SCBP對H2O2誘導RAW 264.7細胞活力的影響

H2O2可直接滲入細胞膜,導致氧化應激、線粒體損傷和細胞結構破壞。為了評估SCBP對H2O2誘導的RAW 264.7細胞氧化損傷的保護作用,采用CCK-8法檢測細胞活力。結果表明(圖2),僅用500 μmol/L的H2O2處理RAW 264.7細胞的存活率與對照組相比明顯降低(P<0.05),這表明H2O2誘導RAW 264.7細胞構建的氧化應激模型成功；然而用SCBP預處理的RAW 264.7細胞,與單獨用500 μmol/L H2O2處理的RAW 264.7細胞相比,細胞存活率顯著提高(P<0.05),表明SCBP對RAW 264.7細胞有明顯保護作用,能緩解H2O2對RAW 264.7細胞的氧化應激損傷。

圖2 SCBP預處理對H2O2誘導損傷的RAW 264.7 細胞活力的影響Fig.2 Effect of SCBP pretreatment on the viability of H2O2-induced RAW 264.7 cells

2.3 抗氧化酶的測定

SOD、CAT和GSH-Px是細胞內抗氧化酶,能抑制自由基對細胞膜的攻擊,維持細胞健康。為檢測SCBP的抗氧化活性,研究了SCBP預處理對H2O2誘導的細胞GSH-Px、SOD和CAT水平的影響。由圖3可知,僅用500 μmol/L H2O2處理12 h后,CAT、GSH-Px和SOD水平與正常組相比均顯著降低(P<0.05),表明H2O2誘導巨噬細胞內抗氧化酶受到嚴重破壞；與單獨H2O2組作用相比,蝦肽低、中、高劑量組的SOD、CAT活力均顯著升高(P<0.05),蝦肽各劑量組的GSH-Px活力有所增高,但無顯著性關系,說明蝦肽可減少氧化應激損傷并減輕脂質過氧化,蝦肽高劑量組減輕H2O2對細胞損傷效果較好。

圖3 SCBP對RAW 264.7細胞的SOD(a)、GSH-Px(b)和CAT(c)水平的影響Fig.3 Effects of SCBP on the levels of SOD(a),GSH-Px(b)and CAT(c)in RAW 264.7 cells.

2.4 SCBP對GPX1/SOD1/NQO1/HO-1/Nrf2基因轉錄表達的影響

為研究SCBP保護氧化損傷RAW 264.7細胞的作用機制,測定了細胞內SOD1、GPX1、Nrf2等 mRNA表達水平,結果如圖4。與空白組相比,單獨H2O2處理的細胞的SOD1、GPX1、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA的表達量均顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,蝦肽高劑量組(600 μg/mL)改善效果較好,蝦肽各劑量組細胞的SOD1、GPX1、HO-1 mRNA的表達量顯著提高(P<0.05)；蝦肽中、高劑量組細胞的Nrf2、NQO1 mRNA的表達量顯著提高(P<0.05),低劑量組(200 μg/mL)沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 SCBP對RAW 264.7細胞的GPX1(a)、SOD1(b)、NQO1(c)、HO-1(d)、Nrf2(e)mRNA表達水平的影響Fig.4 Effect of SCBP on the mRNA expression of GPX 1(a)、SOD1 (b)、NQO1(c)、HO-1(d)、Nrf2(e)in RAW 264.7 cells.

2.5 SCBP對Keap1-Nrf2信號通路的影響

通過Western Blotting檢測Nrf2以及Keap1的蛋白表達,探討SCBP抗氧化作用的分子機制。結果見圖5。與空白組相比,模型組的Nrf2的相對表達量顯著增加,而Keap1的相對表達量顯著降低(P<0.05)。不同劑量的SCBP均顯著地上調了Nrf2的表達,同時使Keap1的表達降低(P<0.05),其中SCBP為600 μg/mL時較其他劑量組顯著增加Nrf2的表達量,顯著減少Keap1的表達量(P<0.05)。說明SCBP通過調節Nrf2-Keap1信號通路來護H2O2誘導的細胞凋亡,具有劑量依賴性。

圖5 SCBP對RAW 264.7細胞Nrf2(a)和Keap1(b)蛋白表達的影響Fig.5 Effect of SCBP on protein expression of Nrf2 (a) and Keap1 (b) in RAW 264.7 cells

3 結論與討論

Nrf2作為一種轉錄因子,在調節體內抗氧化基因的產生和表達中起著關鍵作用。ARE是HO-1、SOD、CAT、GPx和NQO1等基因的上游啟動子區域,Nrf2通常與ARE結合,酶復合物上調了組織中內源性抗氧化基因的表達,從而維持細胞氧化和抗氧化水平的平衡[22]。研究表明HO-1等細胞內氧化還原基因是受Nrf2-ARE信號通路調控的主要內源性保護基因[23]。HO-1具有多種作用,HO-1的高表達可顯著降低多種炎癥反應,減少組織損傷[24]。HO-1還可以調節血管平滑肌增生,維持血小板聚集和血管張力[25]。ARE激活后可誘導NQO1,對氧化應激反應具有保護作用[26]。SOD是細胞內主要的抗氧化酶,也是細胞內主要的自由基清除劑,具有保護細胞免受氧自由基侵害的作用。SOD的水平可以反映內源性氧自由基清除系統的功能[27]。Keap1-Nrf2信號通路在保護細胞免受內源性和外源性應激的影響中起著重要作用[28]。細胞質蛋白Keap1與Nrf2相互作用并抑制其功能。在非應激細胞中,Nrf2與其抑制蛋白Keap1形成復合物,從而使其在細胞質中失活并被阻斷。然而,當細胞暴露于輕度氧化應激時,Nrf2在其特定絲氨酸或蘇氨酸殘基處被磷酸化,從Keap1解離并轉移到細胞核中[29]。在本研究中,不同濃度蝦肽能促進抗氧化基因SOD1、GPX1、Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA水平表達,其表達水平隨著濃度的增加而有所增強,質量濃度為600 μg/mL時具有較好的促進作用。各劑量組蝦肽均能顯著增加Nrf2的蛋白表達,減少Keap1的蛋白表達,高劑量蝦肽效果顯著。表明蝦肽預處理可使H2O2刺激后的細胞抗氧化基因表達增加,增加Nrf2蛋白表達量,減少Keap1蛋白表達量,從而緩解氧化應激。

綜上,蝦肽能緩解H2O2所引起的RAW 264.7細胞存活率降低,提高細胞內SOD、GSH-Px、CAT活力,增加SOD1、GPX1、Nrf2等抗氧化基因的表達量,上調Nrf2的蛋白表達,下調Keap1的蛋白表達,說明蝦肽對H2O2引起的RAW264.7細胞氧化損傷具有一定的保護作用,與Nrf2/Keap1信號通路的激活有關,為開發天然抗氧化劑奠定了基礎。