不同菌種發酵枸杞酵素對酒精性肝損傷的保護作用

馮琳,常明,唐年初

(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

枸杞(Lyciumbarbarum),又稱枸杞子、紅耳墜,為茄科枸杞屬,是一種 “藥食同源”的植物性保健食品[1]。現代醫學研究充分表明,枸杞多糖、β-胡蘿卜素、甜菜堿、牛磺酸、黃酮是枸杞中重要的有效活性成分[2],具有較強的生理活性、細胞保護作用和免疫活性,對抗腫瘤、保肝、降壓、降血糖、抗衰老具有一定功效[3]。近年來,關于枸杞的研究主要集中在枸杞深加工[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]和抗衰老等功效研究以及發酵過程中活性物質的變化等動態過程研究[7]。

目前,枸杞多糖能有效減輕化學毒素引起的壞死性炎癥[8]和氧化應激[9],作為一種食品補充劑在預防肝臟疾病方面具有很大的應用潛力。酒精性肝損傷已經成為威脅人類健康和生命的一大疾病[10],預防和治療酒精性肝損傷的重要機制主要為降低氧化應激、壞死性炎癥和核轉錄因子活性從而實現肝臟損傷的保護作用[11],還涉及各途徑介導的腸道菌群失調,腸屏障功能障礙等[12]。

為使得枸杞的有效成分得到利用,除對枸杞多糖、黃酮等提取加工成功能食品外,還可利用生物技術發酵這種成本較低且能廣泛應用的深加工方式。通過控制微生物的生長,酶的釋放將枸杞中成分轉化，制備具有健康益處的飲料[13-14]。植物細胞壁的結構使胞漿中的活性成分不易提取出來,微生物在代謝過程中會產生多種酶,這些酶會破壞植物細胞壁的結構或者對細胞壁結構加以修飾,使得枸杞中的活性物質容易釋放出來[15]。發酵能產生獨特的風味、香氣和質地,也可用于食品品質改良及風味提升。在加工生產中,乳酸菌被廣泛使用,酵母菌MN0110自身能夠產生超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等具有強抗氧化性的物質,提高自由基的清除能力并緩解脂質氧化[16]。

本研究采用乳桿菌MN1030、乳桿菌MN0727、乳桿菌MN0930和酵母菌MN0110對寧夏枸杞原漿進行液態發酵,通過ADH激活率和SOD酶活力優化各自的發酵工藝。對發酵后的枸杞酵素分別進行對HepG2細胞酒精性損傷模型的保護作用評價。以期選擇能夠增強枸杞酵素解酒護肝功效的的菌種,為開發保護酒精性肝損傷的功能性食品提供基本依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

寧夏干果,寧夏潤德健康產業有限公司(2020年)；酪蛋白胨、牛肉膏、酵母菌MN0110粉、乙酸鈉、檸檬酸二胺、瓊脂、葡萄糖、三氯乙酸,國藥集團化學試劑有限公司；纖維素酶50 000 U/g、果膠酶30 000 U/g、D-異抗壞血酸鈉(VC鈉)、食品添加劑,食全食美有限責任公司；酵母菌MN0110(LactobacillusMN0110)、乳桿菌MN0727(LactobacillusMN1030)、乳桿菌MN0930(LactobacillusMN0727)、乳桿菌MN1030(LactobacillusMN0930),實驗室保藏。HepG2細胞(實驗代數為27～41代),中科院上海細胞庫。BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)細胞毒性試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)(T-SOD)、RIPA裂解液(強),上海碧云天生物技術有限公司；谷氨酸-丙酮酸轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.2 儀器與設備

AL04型電子分析天平(感量0.000 1 g),梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；L12-Energy61型打漿機,九陽股份有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；ZHJH-112B超凈工作臺,上海智城分析儀器有限公司；ZWY-211B恒溫培養箱,上海一恒科技有限公司；Multiskan GO 全波長酶標儀,賽默飛科技有限公司；Centrifuge 5415R 高速冷凍離心機,艾本德股份公司(德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

枸杞→熱燙→護色→預煮→榨汁→酶解→滅菌→冷卻→接菌→發酵→離心→酵素→清汁→調味→高壓均質→滅菌

1.2.2 發酵菌液的制備

菌種的活化：將乳桿菌MN1030、乳桿菌MN0930、乳桿菌MN0727分別劃線接種到MRS、MC、MRS培養基上,37 ℃培養48 h。

液體擴大培養至OD600為0.5～0.6,用無菌水洗滌2遍,調整至1×107CFU/mL。

酵母菌MN0110的活化：將酵母粉按10%的比例加入到滅菌水中,35 ℃活化30 min。

1.2.3 枸杞發酵原漿的制備工藝

將干枸杞先經過熱燙,撈出后,枸杞以1∶4的料水比在80 ℃的水中浸提30 min,加入0.3%的Vc鈉作為護色劑,冷卻后打漿,得到漿料。采用復合酶[m(纖維素酶)∶m(果膠酶)=2∶8],酶解條件：酶解溫度40 ℃；酶解時間3 h；加酶量0.2%。

1.2.4 發酵工藝的條件優化

1.2.4.1 枸杞酵素的單因素試驗

調整初始pH為5.5,接種量為3%,在37 ℃下分別發酵36 h,探究不同加糖量(1%、2%、3%、4%、5%),接菌量(1%、3%、5%、7%、9%)對枸杞原漿發酵的影響,根據SOD酶活力,ADH激活率確定接菌量。分別在發酵溫度(29、33、37、41、45 ℃)下對枸杞原漿進行發酵,對枸杞原漿進行不同時間的發酵(12、24、36、48、60 h),根據SOD酶活力,ADH激活率確定最優發酵條件。

1.2.4.2 SOD酶活力和ADH激活率的測定

將以上4種枸杞酵素液先超聲波處理30 min,再于4 000 r/min離心15 min,取上清液,根據SOD酶試劑盒說明書進行SOD酶活力的測定。根據瓦勒-霍赫(Valle &Hoch)法[17]測定ADH的激活率。SOD活性已成為抗衰老藥物和抗衰老保健食品的一個重要指標,被廣泛用作組織中抗氧化劑狀態的指標。

1.2.5 HepG2 肝癌細胞上驗證酒精性肝損傷的保護作用

1.2.5.1 酒精性HepG2肝細胞損傷模型的建立

按盧夢瑤[18]的方法培養細胞,待細胞密度達到70%～80%后,使用不完全培養基(只含0.5%的雙抗)將無水乙醇稀釋成500、600、700、800、900、1 000 mmol/L,每個濃度設置6個復孔。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT比色法)測定細胞的存活率篩選乙醇的作用濃度和作用時間[19]使用酶標儀在570 nm下測定每孔的吸光值,細胞存活率的計算如公式(1)所示：

(1)

在MTT法篩選出的細胞存活率為50%處選擇造模濃度范圍,每個濃度設置6個復孔。LDH泄露率多用來比較細胞損傷程度,以及評估藥物治療作用效果[20],采用LDH泄露率確定最終造模濃度。使用酶標儀在490 nm下測定每個孔的吸光值,LDH泄露率的計算如公式(2)所示：

(2)

1.2.5.2 枸杞酵素的細胞毒性分析

細胞培養條件如1.2.5.1,將以上選擇的造模濃度作用于分別培養3、6、12、24、36、48 h的細胞,采用MTT法研究不同的枸杞酵素在不同濃度下對HepG2的毒性作用。

1.2.5.3 細胞上清液中AST、ALT、LDH的測定

LDH用來檢測細胞膜通透性的改變,AST和ALT的釋放量能夠反應肝細胞的受損程度。不同濃度的酵素提取液作用相同時間,選取1.2.5中最佳酒精造模濃度和時間繼續孵育相同時間。以不做任何處理的細胞組為對照組,不經過給藥處理的但經過酒精造模的組別作為模型組。分別檢測上清液中ALT、AST、LDH的產生量,并用各孔的蛋白總量進行校正,評價不同菌種最優發酵條件下對HepG2酒精性細胞損傷的保護作用。

1.2.5.4 細胞內丙二醛(malondialdehyde,MDA)、ADH、SOD的測定

條件同1.2.5.3參照試劑盒的方法檢測細胞內ADH激活率、MDA與SOD活力。ADH激活率一般反映細胞的解酒能力,MDA的含量反映脂質過氧化與損傷程度,SOD水平反映對細胞過氧化表達的保護作用。

1.2.6 試驗數據分析

每個樣品至少做3次平行,所有的試驗數據均表示為平均值±標準差,采用SPSS 25.0軟件對數據進行單因素方差分析(ANOVA 法),以P<0.01 表示極顯著的差異,P<0.05表示顯著性差異。圖表采用Origin 2018繪制。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝的條件優化

2.1.1 接菌量

在一定范圍內,不同的接菌量影響發酵酵素的產酸的速度,在一定范圍的pH下,菌種的生長又能受到pH的影響。此外,接種量的增多能夠縮短發酵時間或縮短延滯期。如圖1,隨著酵母菌MN0110接菌量的增加,ADH激活率逐漸增大,SOD酶活力緩慢上升后趨于不變,在5%時達到最大。乳桿菌MN0727隨著接菌量的增加,在5%接種量下ADH激活率達到最大,但SOD酶活力卻相對較小,選則3%作為接菌量。乳桿菌MN1030和乳桿菌MN0930變化趨勢一致,SOD酶活力分別于5%,3%時達到最大。綜合以上,乳桿菌MN0727、乳桿菌MN0930最優接菌量為3%,酵母菌MN0110、乳桿菌MN103最優接菌量為5%。

圖1 接菌量對ADH激活率和SOD酶活力的影響Fig.1 Effect of the amount of inoculation amount on ADH activation rate and SOD activity 注：不同字母不同表示同一菌種在不同加糖量之間的差異, 字母不同表明差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 發酵溫度

為了探究溫度對不同菌種發酵枸杞酵素產生的影響,設置不同溫度作為發酵條件(圖2)。菌種在發酵過程中溫度過低或過高,菌種生長緩慢,ADH激活率和SOD酶活力降低。因此,選擇了37 ℃作為乳桿菌MN0727和乳桿菌MN1030的最終發酵溫度,29 ℃作為酵母菌MN0110的發酵溫度,41 ℃作為乳桿菌MN0930的最終發酵溫度。

圖2 發酵溫度對ADH激活率和SOD酶活力的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on ADH activation rate and SOD activity

2.1.3 發酵時間

由圖3可知,不同種類的菌種對于ADH激活率和SOD酶活力的影響各不相同,主要是由于菌種的不同特性決定的。4種菌種除乳桿菌MN1030發酵枸杞酵素在ADH的激活率呈現先上升后下降的趨勢。隨著發酵時間的延長,SOD酶活均呈現先緩慢升高后下降的趨勢。因此,乳桿菌MN0727枸杞酵素和枸杞酵素的最佳發酵時間為36 h,乳桿菌MN1030的最優發酵時間為48 h,乳桿菌MN0930的最優發酵時間為24 h。

圖3 發酵時間對ADH激活率和SOD酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation time on ADH activation rate and SOD activity

2.2 HepG2 肝癌細胞上驗證酒精性肝損傷的保護作用

2.2.1 MTT篩選造模濃度和給藥濃度

用 HepG2 細胞為模型細胞,用酒精為損傷誘導劑,構建 HepG2 細胞酒精性損傷模型。利用MTT法檢測發現(圖4),隨著酒精濃度的上升,細胞的存活率逐漸下降,在700 mmol/L時達到IC50。選取500、600、700 mmol/L濃度測定LDH泄露率。當酒精濃度為600 mmol/L左右時,細胞存活率在50%左右,超過半數致死率,說明造模的酒精濃度給細胞造成損傷但又不至于造成細胞全部死亡,對應的濃度為建立 HepG2 細胞酒精性損傷模型的最佳損傷濃度。

未做任何處理的細胞對照組的LDH泄露率為100%,此時,不同的造模濃度的泄露量分別為127.80%、153.21%、152.77%。酶的泄露量在600和700 mmol/L相差不多,由于后面繼續添加給藥組,時間增加24 h,可能也會給細胞帶來損傷。因此,將HepG2細胞酒精性損傷模型的造模酒精濃度設置為600 mmol/L。

a-酒精作用濃度對對HepG2細胞存活率的影響；b-造模酒精濃度對LDH泄露率的影響；c-酒精作用時間對HepG2細胞存活率的影響圖4 酒精性肝損傷造模條件Fig.4 Model conditions of alcoholic liver injury.

2.2.2 給藥濃度

由圖5可知,原漿和4個不同菌種枸杞酵素處理組在400 μg/mL以內,HepG2 細胞存活率均在90%以上,不顯示毒性作用,且各樣品組的細胞存活率相近,說明試驗所選各樣品質量濃度均不會影響HepG-2 細胞的正常生長,因此將400 μg/mL作為后續的實驗質量濃度。

圖5 不同菌種發酵枸杞酵素預處理對HepG2 細胞存活率的影響Fig.5 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the viability rate of HepG2 cells

2.2.3 ADH

由圖6可知,乳桿菌MN1030發酵枸杞酵素,酵母菌MN0110均可顯著提高受損細胞中的ADH活力(P<0.01)。ADH的酶活性在酒精處理后會由于細胞損傷和酒精代謝而增加。酵素組處理后,HepG2細胞中ADH活性升高,說明增強了酒精的代謝,防止乙醛積聚來迅速緩解乙醇誘導的HepG2細胞損傷。

圖6 不同菌種發酵枸杞酵素預處理對酒精性肝損傷 HepG2細胞中ADH活力的影響Fig.6 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the content of ADH in HepG2 cells induced by alcohol

2.2.4 AST和ALT

ALT全部存在于細胞基質中,AST有20%存在細胞質基質中,80%存在線粒體中[21]。AST,ALT是體內重要的轉氨酶,主要存在細胞內,當肝細胞受損時,細胞膜的通透性增加,酶被釋放到胞外。通過酒精性損傷細胞、AST和ALT的釋放量能夠反應肝細胞的受損程度。炎癥和ROS的產生會導致細胞外的AST和ALT含量產生變化,細胞損傷程度輕,胞內的ALT和部分AST逸出,細胞損傷程度重,線粒體內的AST逸出。酒精的處理可能導致細胞膜和線粒體損傷,AST和ALT被釋放到細胞外。與模型組相比,乳桿菌MN0930發酵處理組和原漿處理組的細胞外AST含量具有一定的下降,但是沒有明顯的差異(P>0.05)。乳桿菌MN0727、酵母菌MN0110、乳桿菌MN1030組均顯著降低了細胞外的AST的含量(P<0.05)。與對照組相比,模型組ALT的含量顯著升高。較模型組,不同劑量組可顯著降低受損干細胞的ALT 的分泌量。乳桿菌MN1030與模型組差異顯著(P<0.01),且與對照組水平相近。說明乳桿菌MN1030酵素組對酒精性肝損傷有較好的干預作用。

圖7 不同菌種發酵枸杞酵素預處理對酒精性肝損傷 HepG2細胞中AST和ALT的影響Fig.7 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the content of AST and ALT in HepG2 cells induced by alcohol

2.2.5 MDA

MDA 作為生物體脂質過氧化的標志物,主要是由于炎癥因子以及ROS等造成細胞內的氧化機制遭受到破壞,引起細胞膜的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化[22]。如圖8所示,與對照組相比,模型組的MDA生成量顯著升高(P<0.01),是對照組的2.94倍。不同菌種發酵枸杞酵素單獨作用于細胞,均可顯著降低受損肝細胞內MDA的產生量,卻不能恢復至細胞的最初水平。對照組的MDA產生量在2.30 μmol/g prot,作用效果最好的酵母菌MN0110和乳桿菌MN1030能將造模組6.77 μmol/g prot分別恢復至2.46和3.81 μmol/g prot。

圖8 不同菌種發酵枸杞酵素預處理對酒精性肝損傷 HepG2細胞中MDA的影響Fig.8 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the content of MDA in HepG2 cells induced by alcohol

MDA的顯著降低說明乳桿菌MN0727和酵母菌MN0110發酵對保護細胞免受脂質過氧化的能力要高于其他處理組。

2.2.6 SOD

SOD是細胞內抵抗氧化應激的主要酶系之一,是SOD、CAT、GSH-Px抗氧化酶系中最重要的一種酶[23]。圖9顯示,模型組較對照組的SOD酶活力顯著降低(P<0.01),細胞內的抗氧化機制已經失衡,細胞已處于氧化損傷狀態。酵素處理組較模型組SOD酶活力均有不同程度的升高,表明酵素處理組能抵御酒精誘導的氧化應激損傷,通過過量表達SOD酶來恢復HepG2細胞的氧化應激機制。其中酵母菌MN0110發酵處理組的SOD酶活力最高,乳桿菌MN1030、乳桿菌MN0930次之、原漿和乳桿菌MN0727最弱。與對照組差異顯著(P<0.01),說明酵素處理并不能完全抵御酒精造成的細胞損傷,但在一定程度上具有保護作用。

圖9 不同菌種發酵枸杞酵素預處理對酒精性肝損傷 HepG2細胞中SOD抗氧化酶活力的影響Fig.9 Effect of fermented Lycium barbarum juice by different strains on the Intracellular SOD antioxidant enzyme activity in HepG2 cells induced by alcohol

3 結論

本實驗將乳桿菌MN1030、酵母菌MN0110、乳桿菌MN0727、乳桿菌MN0930接種于枸杞原漿進行發酵,通過對發酵條件(接菌量、時間、溫度)進行優化,確定具有潛在護肝功能的枸杞酵素的最優發酵條件。使用最優發酵條件下不同菌種發酵的枸杞酵素作用細胞,能顯著降低造模組MDA的產生、AST和ALT的分泌量,顯著增加SOD酶活力和ADH 的激活率。結果表明,處理組對損傷細胞均具有保護作用,其中酵母菌MN0110和乳桿菌MN1030的保護作用最為顯著(P<0.01),未發酵原漿對損傷細胞有保護作用,但是效果不顯著(P>0.05)。酵母菌MN0110和乳桿菌MN1030發酵的枸杞酵素可從氧化應激、脂質代謝方面對緩解酒精性肝損傷具有一定功效。