基于分子對接和網絡藥理學的僵蠶息風止痙作用機制分析

王巧宇，劉瑩，申金田，王開元，梅榮，湯建，張林松，聞崇煒

(1. 江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 鎮江市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 鎮江 212050； 3. 亳州學院中藥學院，安徽 亳州 236800)

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶BombyxmoriLinnaeus的幼蟲感染白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant而致死的干燥體，圓柱形，多彎曲皺縮；氣微腥，味微咸，性平，歸肝、肺、胃經，具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結之功效[1]。研究發現僵蠶多種化學成分(包括蛋白質、多肽、氨基酸、甾體、黃酮、有機酸等)具有抗驚厥、抗凝、抗菌、抗癌、降糖、降脂、神經營養和保護等作用[2]。研究表明[3-4]，僵蠶粉末抗驚厥效果優于僵蠶煎液，能夠顯著降低小鼠驚厥率，僵蠶提取物對最大電休克驚厥模型有對抗作用。

網絡藥理學是基于系統生物學理論而發展出的新的研究手段，它通過高通量組學數據分析、軟件處理，構建“藥物-活性成分-靶點”的網絡，將藥物與機體的作用整體系統地表現出來。中藥具有多組分、多靶點、多途徑的特點，通過網絡藥理學研究可以提供可量化數據，科學解讀中藥治療疾病的作用機制[5-6]。目前，僵蠶的息風止痙作用機制尚不明確。本文采用網絡藥理學方法，探索僵蠶主要物質基礎與靶點、疾病的相互作用關系，以系統、全面地闡述僵蠶息風止痙的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

PubChem數據庫 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org/)、David生物信息注釋系統 (https://david.ncifcrf.gov/)、KEGG數據庫(http://www.genome.jp/kegg/)、STRING數據庫(https://string-db.org/)、Swiss Target Prediction、ChemDraw14.0、Cystoscape 3.5.1、Open Babel 2.4.1。

1.2 僵蠶化學成分的收集與整理

通過文獻檢索僵蠶的化學成分，剔除氨基酸及核苷等成分，利用 PubChem 數據庫獲取相關成分的3D化學結構，并采用ChemDraw 軟件繪制PubChem 數據庫中未收載的成分，所有化學結構文件均采用 Open Babel 2. 4. 1 軟件轉換為Smiles格式保存。

1.3 僵蠶化學成分潛在靶點的預測與篩選

將僵蠶化學成分的Smiles格式上傳至Swiss Target Prediction分析軟件，設置屬性為“Homo sapiens”進行靶點的預測與篩選，并提取靶蛋白、靶基因名稱。

1.4 僵蠶抗驚厥潛在作用靶點及注釋

將驚厥(convulsions)作為關鍵詞輸入DisGeNET數據庫，檢索相關的人類基因，再將獲得的靶點信息與僵蠶活性成分潛在靶點相比對，最后得到僵蠶息風止痙作用的靶點及蛋白信息。

1.5 僵蠶抗驚厥“活性成分-靶點”網絡的構建

使用Cytoscape軟件構建“藥物-活性成分-靶點”網絡模式，繪制僵蠶成分與其治療驚厥靶點的作用網絡圖。

1.6 僵蠶抗驚厥靶點PPI網絡的構建與分析

使用STRING數據庫構建僵蠶靶蛋白之間的相互作用網絡(PPI)，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”、最低相互作用閾值設為“medium confidence”，其余參數均保持默認操作。用Cytoscape軟件中的“Network Analyzer”插件，分析PPI網絡的拓撲屬性，計算“節點度值分布”和“介數中心性”網絡拓撲參數，進而獲得僵蠶治療驚厥的關鍵靶點。

1.7 基因功能分析與通路富集分析

利用Cytoscape軟件中的“BiNGO”插件從生物過程、分子功能以及細胞組成3個方面對僵蠶治療驚厥的潛在作用靶點進行 GO 富集分析。另外，利用David平臺對僵蠶治療驚厥的潛在作用靶點進行KEGG通路富集分析。

1.8 分子對接模擬

將篩選出的主要活性成分通過PubChem下載其SDF格式，將篩選的主要蛋白靶點通過 PDB 數據庫選擇其最佳蛋白晶體結構，并下載其PDB格式文件。將下載好的蛋白質及活性成分導入PyMol進行拆分、格式轉化等預處理。蛋白靶點及化學成分導入 AutoDock軟件，進行除水、加氫，計算電荷，運行軟件對活性成分和靶點蛋白分別進行對接。在輸出結果中，結合能越低，表明活性成分與靶蛋白之間的結合力越強。

2 結果

2.1 僵蠶的化學成分

文獻檢索獲得僵蠶18個化學活性成分，其中多肽類2個、甾體類9個、黃酮類5個、有機酸類2個。

2.2 僵蠶化學成分抗驚厥潛在靶點的預測與篩選

基于Swiss Target Prediction平臺預測上述化學成分的潛在作用靶點，除quercetin-4′-O-methyl-7-O-b-D-glucopyranoside未找到作用靶點外，其他17個成分共獲得作用靶點1 311個，刪除重復項后獲取有效作用靶點513個。以Convulsions為關鍵詞，基于DisGeNET數據庫，檢索得到相關基因117個，將僵蠶活性成分靶點與驚厥致病基因進行比對，得到僵蠶抗驚厥作用靶點共22個，提取靶點相關信息。包括丁酰膽堿酯酶(Butyrylcholinesterase)、多巴胺D4受體(Dopamine D4 receptor)以及環氧合酶2(Cyclooxygenase-2)等22個靶點均與僵蠶抗驚厥有直接或間接作用。

2.3 僵蠶活性成分-靶點網絡的構建

以Cytoscape軟件對僵蠶活性成分與作用靶點的對應關系進行圖形化展示并構建活性成分-靶點網絡。18個活性成分中有16個與僵蠶抗驚厥靶點有直接作用(圖1)。由網絡拓撲學結構數據可知化合物的中位度數為5，篩選出度值≥5的化合物有3β,5α-二羥基-(22E,24R)-麥角甾醇-7,22-dien-6-酮；(22E,24S)-5,8-環氧-24-甲基膽甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇；22E-7α-甲氧基-5α,6α-環氧麥角甾醇8(14),22-dien-3β-醇；環(L-脯-L-纈)；山奈酚；環(丙脯)二肽；槲皮素；豆甾烷-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇；5,6-環氧-(22E,24R)-麥角甾醇-8(14)22-二烯-3,7-二醇；度值分別為10、9、7、6、6、5、5、5、5，這9個化合物可能是僵蠶息風止痙的主要物質基礎。

圖1 僵蠶“藥物-活性成分-靶點”網絡關系圖

2.4 僵蠶抗驚厥靶點PPI網絡的構建與分析

PPI網絡分析發現有20個節點、58條相互作用連線(圖2)，線條的粗細代表了相互作用力的強弱，度值平均為5.8，介數平均為5.029 2×10-2。靶點度值和介數均超過平均值的靶點共有6個(表1)，包括Interleukin-6、Mu opioid receptor等。

表1 關鍵靶點的拓撲參數

圖2 僵蠶抗驚厥作用靶點的PPI網絡圖

2.5 基因功能分析與通路富集分析

GO富集分析結果如圖3所示，22個靶點主要在細胞膜上通過調節細胞過程、細胞轉運活性和受體活性，對刺激應答等生物過程發揮作用。

圖3 僵蠶抗驚厥靶點GO富集分析

KEGG通路富集共篩選出有關神經遞質、內分泌、信號轉導、物質代謝等9條信號通路(圖4)。

圖4 僵蠶主要靶點 KEGG 富集通路氣泡圖

2.6 分子對接模擬

分子對接結果經過熱圖分析得到圖5(對接結果只保留每對分子對接的結合能絕對值最高的)，對接打分的絕對值≥7的活性成分有5個(9.26%)，絕對值在7到3.5之間的有47個(87.03%)，絕對值<3.5的有2個(3.70%)。僵蠶中活性成分與驚厥潛在靶點分子的結合圖見圖6。

compound 1: 3β,5α-二羥基-(22E,24R)-麥角甾醇-7,22-dien-6-酮；compound 2: (22E,24S)-5,8-環氧-24-甲基膽甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇；compound 3: 22E-7α-甲氧基-5α,6α-環氧麥角甾醇8(14),22-dien-3β-醇；compound 4: 環(L-脯-L-纈)；compound 5: 山奈酚；compound 6: 環(丙脯)二肽；compound 7: 槲皮素；compound 8: 豆甾烷-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇；compound 9: 5,6-環氧-(22E,24R)-麥角甾醇-8(14)22-二烯-3,7-二醇。無原配體的蛋白靶點以-4 kcal/mol為打分值，用“×”標注

3 討論

驚厥是兒科常見急癥，也是最常見的小兒神經系統癥狀，以臨床出現肢體節律性抽搐、昏迷為主要特征。引起驚厥發作的病因有很多，主要以熱性驚厥、顱內感染和癲癇為主[7]。驚厥的頻繁發作或持續狀態可危及患兒生命或使患兒腦部損傷，影響小兒的智力發育和健康。研究表明[8]，腦細胞生理代謝發生變化可使鈣離子泵功能失調，鈉、鈣離子增多，使腦細胞腫脹、結構損害甚至死亡。臨床上抗驚厥的藥物有很多，通過網絡藥理學可以分析其可能的作用機制。

在PPI網絡圖中得到靶點度值和介數均超過平均值的靶點有IL-6、PTGS2、CNR1、DRD2、ACHE和OPRM1。IL-6基因在胚胎發育過程中，作為信號分子從肝竇內皮細胞中分泌，影響肝小葉的生長與功能。ACHE在類紅細胞和神經元突觸中表達。在脊椎動物中，乙酰膽堿是神經元之間信息傳遞的關鍵物質[9]，可將信號從神經系統傳遞到肌肉纖維的興奮性神經遞質，刺激肌肉使肌肉僵直。已有研究表明，乙酰膽堿受體與多種神經系統疾病密切相關，如癲癇、精神分裂癥、老年癡呆癥等[10]，提示IL-6與ACHE在治療神經系統疾病方面發揮重要作用，這也說明僵蠶治療癲癇、驚厥等病癥具有一定的功效。

A：PTGS2和compound 3；B：OPRM1和compound 6；C：IL-6和compound 6；D：DRD2和compound 6；E：CNR1和compound 2；F：ACHE和compound 3

GO富集與KEGG通路富集分析結果顯示，僵蠶抗驚厥作用靶點主要分布在細胞膜上，具有受體活性、細胞轉運活性、蛋白質結合及對刺激應答等功能，并通過神經遞質、內分泌、信號轉導、物質代謝等9條信號通路發揮作用，預測的靶點和通路大多與神經保護密切相關，靶點與通路協調發揮抗驚厥作用，提示這可能是治療驚厥的關鍵。驚厥的發病部位主要是神經系統，神經活性配體-受體相互作用通路與高熱驚厥和夜間額葉癲病相關，抗內源性大麻素信號通路與嬰兒早期癲癇性腦病相關，膽堿能突觸通路與良性家族性新生兒驚厥和夜間額葉癲癇疾病相關，可以推測這些是僵蠶抗驚厥作用的關鍵通路[9-10]。已有文獻報道[11]，尼古丁成癮性通路可參與神經轉導、免疫及代謝過程，對中樞神經系統和外周神經系統都存在廣泛的影響。此外有研究證實缺氧誘導因子1(HIF-1)信號通路與神經干細胞的功能密切相關[12]，HIF-1通過調控其靶點的表達來適應不同的氧氣水平，精確的氧氣濃度控制也為神經系統疾病的治療提供了新的切入點[13]。賀銳等[14]研究表明，鈣信號通路能夠調節Ca2+介導的突觸后膜去極化，使內源性大麻素與突觸前膜大麻素1型(CB1)受體結合，從而對抗神經元過度興奮。脂肪水解酶1(FAAH1)是一種內源性大麻素水解酶，其可在神經系統和肝臟中表達，研究表明[15]，FAAH1抑制劑能夠抵抗海人酸誘導的海馬神經元興奮毒性，顯著減少大鼠的癲癇行為。可見FAAH1的適當抑制和抗內源性大麻素信號通路協調作用可以有效抑制癲癇疾病的發作。僵蠶息風止痙歸肝經的理論與本研究結果不謀而合，證實了預測實驗的準確性。

本研究通過網絡分析平臺，系統地研究了僵蠶抗驚厥作用機制，構建了僵蠶“活性成分-靶點-通路-疾病”網絡，為臨床治療驚厥提供了參考。