α干擾素增強順鉑誘導的骨肉瘤細胞凋亡

黃秀芳 原向偉 秦 英 向珊珊 陳忠羨

1.中山大學附屬江門醫院 廣東省江門市中心醫院病理科，廣東江門 529030；2.中山大學附屬江門醫院 廣東省江門市中心醫院脊柱骨科，廣東江門529030

在骨組織原發惡性腫瘤中，骨肉瘤發病率最高，常早期出現肺部轉移，預后不良。術前術后新輔助化療聯合外科手術是骨肉瘤的主要治療方式，但常因為耐藥或毒副作用導致化療失敗，從而使患者喪失手術機會或腫瘤復發，甚至喪失生命[1]。干擾素作為生物治療方式之一，已被用于多種惡性腫瘤的治療，還可與傳統化療藥物協同治療惡性腫瘤，增強化療敏感性[2]，但相關研究在骨肉瘤罕見報道，因此本文設計α干擾素（interferon-α，IFN-α）與順鉑（cisplatin）聯合處理骨肉瘤細胞U2OS（p53正常）和MG63（p53突變），觀察其抗腫瘤效應，并分析其分子機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與試劑

骨肉瘤細胞U2OS（p53基因正常，ARF基因啟動子甲基化[3]）和MG63（p53基因突變，ARF基因純合缺失[3]）來自中山大學病理教研室，培養液為含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM，5%CO2培養箱37℃培養。Opti-MEM、Lipofectamine 2000、TRIzol購于Invitrogen公司。dNTP、Taq酶等PCR試劑購自上海申能博采，RNASIN、M-MLV為Promega產 品。IFN-α為Peprotech產品（300-02AB），順鉑（479306-1G）、MTT、碘化丙啶（PI）均為Sigma產品，本研究全部抗體均來自Santa Cruz。

1.2 MTT法檢測細胞活力

96孔板加順鉑，對照組加同體積的培養液，加藥68 h后加MTT（濃度5 mg/ml）10 μl，72 h培養結束棄上清，每孔加0.1 ml二甲亞砜（DMSO），酶標儀檢測吸光度A，細胞活力計算公式為：處理組平均OD值/對照組平均OD值×100%。

1.3 流式細胞術

細胞用70%乙醇固定，加10 μmol/L的PI和RNase于4℃避光處理30 min，流式細胞儀檢測凋亡比例。

1.4 Hoechst 33258熒光染色

細胞加固定液0.5 ml于4℃固定10 min，去固定液清洗后加入10 μg/ml的Hoechst 33258避光染色15 min，PBS重懸，熒光顯微鏡檢測凋亡并采集圖像。

1.5 RT-PCR

用TRIzol提取細胞總RNA，取提取物2 μg構建25 μl的 逆轉錄體系，于42℃60 min，75℃10 min逆轉錄。取1 μl逆轉錄產物進行PCR，PCR引物序列為：β-actin：上游：5'-A C T A C C T C A T G A A G A T C C T C-3'，下游：5'-CTAAAGATTGCGTGGCGAGG-3'，p53：上游：5’-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3’，下游：5’-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3’，由上海英駿生物技術公司合成。94℃變性3 min，循環設置如下：94℃50 s、56℃（β-actin）或58℃（p53）50 s，72℃延伸1 min，共33個循環，然 后72℃延伸6 min；取8 μl產物行2%瓊脂糖凝膠電泳并成像保存。

1.6 Western blot

細胞加裂解液提取蛋白，BCA法檢測并調整蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后蛋白濕式電轉至PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉的TBST4℃封閉過夜；1/600稀釋抗體，室溫孵育2 h，二抗4℃孵育過夜，ECL顯像并定影，收集圖像。

1.7 統計學處理

使用SPSS 16.0統計學軟件進行統計，計量資料用（）表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFN-α在U2OS細胞而非MG63細胞中增強順鉑誘導的生長抑制

如圖1，處理72 h，相對于對照組，IFN-α單獨對U2OS和MG63細胞的生長無影響，順鉑單獨可降低U2OS和MG63的細胞活力，而IFN-α可明顯增強順鉑引起的U2OS細胞而非MG63細胞生長抑制，在U2OS細胞中，IFN-α+順鉑組細胞活力低于順鉑組，差異有統計學意義（χ2=17.385，P＜0.001）。

圖1 IFN-α在U2OS和MG63細胞中對順鉑誘導生長抑制的影響

2.2 IFN-α在U2OS細胞而非MG63細胞中增強順鉑誘導的凋亡

如圖2所示，處理72 h后，順鉑組增加了U2OS和MG63細胞凋亡，并且IFN-α明顯增強順鉑誘導的U2OS細胞而非MG63細胞凋亡，在U2OS細胞中，IFN-α+順鉑組細胞凋亡率高于順鉑組，差異有統計學意義（χ2=15.647，P＜0.001）。

圖2 IFN-α在U2OS和MG63細胞中對順鉑介導細胞凋亡的影響

2.3 IFN-α增強順鉑引起的U2OS細胞凋亡形態變化和PARP裂解

Hoechst33258熒光染色可顯示凋亡特征性細胞核改變，藥物處理72 h后，對照組、IFN-α組中可見細胞核呈均勻藍色熒光，無明顯強化；在順鉑組可見少部分染色強化、破裂和縮小的細胞核，并有染色質凝聚等凋亡表現，更多細胞凋亡性變化出現于IFN-α+順鉑組（圖3A）。PARP裂解是凋亡鑒定的重要指標[4]，相對于其他組，IFN-α+順鉑組PARP出現明顯活化裂解，產生85KD的活性片段（圖3B）。

圖3 IFN-α增強順鉑引起的U2OS細胞凋亡形態變化和PARP裂解

2.4 p53及其下游基因的表達

如圖4A，在U2OS細胞中，IFN-α對各基因的表達無影響，p53、p21的表達可被順鉑增強，其中p53表達被IFN-α+順鉑進一步增強。而Bax和Bcl-2的表達在順鉑組無明顯改變，但在IFN-α+順鉑組，Bax表達上調，Bcl-2表達下調。而在MG63細胞中，各基因的表達均無明顯變化。RT-PCR顯示U2OS細胞中p53的mRNA表達被順鉑上調，但IFN-α+順鉑未進一步上調其表達（圖4B）。

圖4 IFN-α+順鉑對p53通路基因表達的影響

3 討論

除了傳統手術、放療、化療，生物治療已成為治療惡性腫瘤的重要方法之一。干擾素家族因其抗腫瘤活性，已被用于肺癌、胃癌、白血病等的生物治療[5-6]。IFN-α屬于Ⅰ類干擾素，也是第一種用于治療腫瘤的細胞因子[7]，IFN-α除了抑制腫瘤細胞生長，還可以介導細胞周期停滯和誘導腫瘤細胞凋亡，直接發揮抗腫瘤效應[8-9]，聯合氟尿嘧啶等傳統化療藥物使用時，可協同增強抗腫瘤作用，從而增強化療藥物敏感性[10]。

化療是人類骨肉瘤的主要治療方式之一，通過化療可抑制腫瘤細胞增殖，延緩病程進展，避免早期肺轉移，縮小腫瘤體積，從而使患者獲得更好的保肢手術條件，避免截肢致殘，并獲得更高的生存率[1]。如何在進一步提高化療療效的同時減少藥物使用劑量，減輕毒副作用，對于骨肉瘤患者的治療和預后有著重要意義。研究表明IFN-α受體是影響骨肉瘤患者預后的重要因子[11]，而且IFN-α單獨即可引起耐藥骨肉瘤細胞的生長抑制[12]，均提示IFN-α可能對骨肉瘤的治療有潛在的應用價值。不過本研究發現IFN-α單獨對骨肉瘤U2OS和MG63細胞的生長均無影響，這可能因為IFN-α的生長抑制作用依賴于ARF基因[13]，而在U2OS和MG63細胞中，ARF基因分別因為啟動子甲基化和基因純合缺失而喪失ARF的正常功能[3]。

順鉑為廣譜抗癌藥，作用機制為激活p53凋亡信號通路，從而誘導細胞凋亡[14]。本研究發現IFN-α聯合順鉑處理p53正常的骨肉瘤U2OS細胞，可明顯增強順鉑引起的生長抑制和凋亡，而此效應未在p53突變的MG63細胞出現，提示p53可能在其中發揮主要作用。因此本研究進一步檢測p53及其下游基因的表達，Western blot表明，IFN-α明顯增強順鉑誘導的p53蛋白水平表達上調，表明p53確實參與了該作用。而RT-PCR顯示p53的mRNA表達被順鉑上調，但沒有被IFN-α進一步提高，提示p53蛋白的上調可能由轉錄后機制介導。而作為IFN-α最重要的靶點基因，STAT1可能是介導該機制的候選，因為在順鉑和阿霉素等DNA損傷性藥物作用下，STAT1已被證明可活化p53依賴性凋亡[15]。

Bax和Bcl-2同為Bcl-2家族成員，是p53下游的凋亡調控基因，二者表達于線粒體，功能相互拮抗，Bax促進凋亡，Bcl-2抑制凋亡，共同介導線粒體凋亡通路[16]。IFN-α+順鉑在U2OS細胞中增強Bax的表達并減少Bcl-2的表達，表明聯合用藥通過p53進一步激活線粒體凋亡通路，促進凋亡發生。p21同樣位于p53下游，是細胞周期的主要調控者，通過引起細胞周期停滯介導生長抑制[17]，但IFN-α并未進一步增強順鉑誘導的p21表達，表明此作用并非細胞周期停滯引起，而主要是凋亡引起。

綜上所述，IFN-α可經由p53信號通路增強順鉑引的骨肉瘤U2OS細胞凋亡，提示IFN-α與傳統化療藥物聯合用于骨肉瘤治療的應用價值，相關研究值得進一步推進。