廿烷五烯酸單藥和聯合用藥誘導肺癌細胞凋亡作用原理的研究

李星 安京華

【摘要】目的：研究廿烷五烯酸在單藥和聯合用藥時對肺癌細胞誘導凋亡作用的可能原理。 方法：應用酶標儀檢測肺癌細胞的活性氧水平。結果：通過檢測肺癌細胞內活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平可知，相比卡鉑組與對照組而言，EPA組和聯合組可明顯提高細胞內ROS水平。結論：單獨使用廿烷五烯酸或用聯合卡鉑治療均可使肺癌細胞內活性氧水平明顯升高，從而使bcl-2表達減弱，可能是肺癌細胞凋亡現象增加的原理之一。

【關鍵詞】廿烷五烯酸；卡鉑；A-549細胞；ROS

[中圖分類號]R734.2 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）03-0033-02

The study on mechanism of induced apoptosis by eicosapentaenoic acid monotherapy and combination therapy

LI Xing1， AN Jing-hua2 （1. Yufa Town Central Hospital ， Daxing Beijing 102602， China； 2. YanBian University Hospital ， Yanji Jilin 133000， China）[Abstract] Objective： To explore the mechanism of induced apoptosis by eicosapentaenoic acid and carboplatin. Methods： Microplate assay was used to determine Reactive oxygen species （ROS） level of human lung cancer cell line A-549. Results： The level of ROS in EPA group and combined group were significantly higher than those in control group and carboplatin group. Conclusions： ROS lever of EPA group and combined group were obviously increased. expression of bcl-2。That maybe increase the apoptosis of lung cancer cells because ROS can reduce expression of bcl-2.

[Key words] Eicosapentaenoic acid； A-549； ROS

廿烷五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）屬于ω-3多不飽和脂肪酸。PUFAs具有良好的抗癌特性。二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）是一類具有生物活性的大分子，它們的抗癌作用是多樣性的。這些多不飽和脂肪酸具有較高的安全性，在體內外均可部分選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞生長。它們還通過增加不同細胞系對特定抗腫瘤藥物的敏感性來提高化療藥物的療效。這些ω-3多不飽和脂肪酸具有多種抗癌作用，但確切的機制尚不清楚。盡管許多研究已經探討了DHA和EPA對實體瘤的作用及其機制，但對于這兩種FAs在血液惡性腫瘤中的作用及其機制還沒有達成共識。目前已有實驗表明ω-3 多不飽和脂肪酸在腫瘤疾病的治療中有作用[1-3]，但其抗腫瘤的具體原理尚處于研究中。本次實驗旨在通過使用EPA單藥和聯合用藥的不同情況下，研究其誘導肺癌細胞凋亡增加的可能原理。

1 材料與方法

1.1細胞系 人肺癌A-549細胞株（北京首都醫科大學惠贈）常規培養于DMEM 培養液中（含10%新生小牛血清），選對數生長期的細胞進行實驗。

1.2主要試劑 EPA：購自美國SIGMA公司；卡鉑：購于齊魯制藥有限公司；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium） 培養基購于美國GIBCO，4℃冰箱保存備用；新生小牛血清（Newborn Calf Serum）：武漢三利生物技術有限公司，置于56℃恒溫水浴箱30min滅活補體，-20℃冰箱保存； ROS試劑盒：購于碧云天生物公司。

1.3酶標儀檢測細胞ROS水平 將A-549細胞制成1×105個/mL細胞懸液，置于六孔板中培養。設立對照組，EPA組（EPA 80μg/mL），卡鉑組（卡鉑100μg/mL），聯合組（EPA 80μg/mL、卡鉑 100μg/mL），每種藥物濃度設6個平行孔，繼續培養48h。光密度值（OD值）使用酶標儀進行檢測。實驗重復三次，取平均值。OD值即可反映細胞內ROS水平。

1.4統計學分析 使用SPSS18.0進行數據分析。數據以均數±標準差（_x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1酶標儀檢測細胞ROS水平 通過實驗結果可知，用藥48h后，卡鉑組與對照組細胞內ROS水平變化無顯著性差異，而EPA組和聯合組則明顯提高細胞內ROS水平，詳見表1。

3 討論

PUFAs是一大類脂肪酸（FAs）的成員，在其結構中具有多個雙鍵。眾所周知，這些具有生物活性的大分子具有細胞正常功能所需的各種重要生理作用。這些FAs的許多作用是通過其更活躍的長鏈代謝物介導的，這些代謝物通過改變質膜組成、產生各種炎癥介質和改變不同基因的表達而起作用。EPA和DHA是長鏈多不飽和脂肪酸（pufa）中的一種，已顯示出多種健康益處。這些FAs通過調節包括血壓、凝血、心律和心率在內的多種危險因素來降低心血管疾病的風險、抗炎和免疫調節作用，其次，這些FAs對多種代謝途徑的調節也有一定的作用，使其在治療炎癥疾病、代謝紊亂（如2型糖尿病）和免疫損害條件中具有潛在的治療利用價值。長期食用含EPA的食物可顯著增加血漿、血小板和紅細胞中EPA的含量，且EPA對惡性細胞都有選擇性作用，對正常細胞的影響較小。EPA的抗腫瘤作用的機制之一是誘導脂質過氧化。其中，保護細胞免受脂質過氧化的主要細胞內機制是GP-x4酶，不同細胞系對EPA的敏感性可能反映了GP-x4在不同健康細胞和腫瘤細胞中的差異表達。這將影響保護細胞免受過氧化損傷的能力。

有關研究報告顯示，體外EPA處理HL-60和K-562細胞后，G0/G1期細胞周期延長，G2/M期縮短，兩種細胞株的壞死率分別為19.6%和4.4%；此外，EPA在HL-60細胞中誘導凋亡的程度更大，其主要通過下調凋亡的主要調節因子bcl-2信號分子的表達來介導，表明EPA（40、60和120μM）可誘導HL-60細胞凋亡，但K562細胞不受EPA對DNA斷裂的影響。盡管不同的EPA敏感和抗EPA白血病細胞系表達不同水平的促凋亡和抗凋亡因子，如c-myc和Bcl-2，但這些因子表達的差異并不能解釋其對不同細胞凋亡的不同影響。

此外，一項研究顯示，EPA對兩種淋巴瘤細胞株Raji和Ramos有誘導壞死和凋亡的作用。使用不同的抗氧化劑逆轉EPA的壞死作用，但對其凋亡作用沒有任何影響，表明氧化應激是EPA誘導壞死的一種手段。EPA誘導的Ramos細胞凋亡是通過EPA對凋亡內在途徑的直接作用而不是干擾細胞周期的進展來介導的。三氮雜合酶C是一種酰基輔酶a合成酶（ACS）抑制劑，它的應用揭示了ACS在EPA誘導的細胞凋亡中的重要作用。使用不同的抗氧化劑逆轉EPA的壞死作用，但對其凋亡作用沒有任何影響，表明氧化應激是EPA誘導壞死的一種手段。EPA誘導的Ramos細胞凋亡是通過EPA對凋亡內在途徑的直接作用而不是干擾細胞周期的進展來介導的。三氮雜合酶C是一種酰基輔酶a合成酶（ACS）抑制劑，它的應用揭示了ACS在 EPA誘導的細胞凋亡中的重要作用。實體瘤患者的I期和II期臨床試驗結果表明，omega-3 FAs是安全的，并且顯示出有希望的結果，特別是在治療后這些FAs的血濃度顯著升高的患者中應用；需要注意的是，EPA改善癌性惡病質的推薦劑量為1.5-2g/天，該劑量的副作用很小，然而，增加劑量的益處尚不清楚。盡管多不飽和脂肪酸增加氧化應激和細胞內脂質過氧化物自由基的產生使其易受氧化損傷這一事實臨床上有所爭論，但多不飽和脂肪酸的消耗已被證明是臨床安全的。

有研究顯示，癌細胞內ROS水平升高，可形成高氧化應激狀態，減少抗凋亡因子bcl-2的表達 [4]，從而增加癌細胞的凋亡現象。在本實驗中使用活性氧檢測試劑盒檢測肺癌A-549細胞中ROS水平，可以發現聯合組和EPA組與對照組或卡鉑組相比較，聯合組和EPA組能顯著引起肺癌A-549細胞內ROS水平升高，且聯合組升高更明顯。因此推測，當EPA單藥或聯合卡鉑時，肺癌細胞內產生大量活性氧，減少了抗凋亡因子bcl-2的表達，從而引起肺癌細胞凋亡，為EPA本身及增強卡鉑抗癌作用的原理之一。

參考文獻

[1] 樓健穎， 吳丹， 林漢庭， 等. ω-3多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸對胃癌細胞株AGS生長和增殖的影響[J]. 中華普通外科雜志， 2007， 22（8）： 613-615.

[2] 秦薇， 朱圣陶. 二十二碳六烯酸對人胰腺癌細胞增殖的抑制[J].中華臨床營養雜志， 2009， 17（1）： 49-52.

[3] 李星， 安京華， 石俊， 等. ω-3多不飽和脂肪酸廿烷五烯酸單劑以及聯合卡鉑對人肺腺癌A-549細胞系增殖和凋亡的影響[J].中華臨床營養雜志， 2012， 20（1）： 30-32.

[4] Mao Y， song G， Cai Q， et al. Hydrogen peroxide-induced apoptosis in human gastric carcinoma MGC803 cells[J]. Cell Biol Int， 2006， 30（4）： 332-327.

作者簡介：李星，北京市大興區榆垡鎮中心衛生院。E-mail：lix0226@163. com