羅哌卡因通過線粒體通路誘導人結直腸癌SW620細胞株凋亡的實驗研究

金晶玉朱成杰權英實黃學洙

(1.延邊大學附屬醫院麻醉科,吉林 延吉 133002;2.延邊大學附屬醫院重癥監護科,吉林 延吉 133002)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種常見消化道腫瘤,可能與結腸炎癥進展、飲食習慣、遺傳等多種因素有關,發病率和死亡率較高[1]。CRC早期一般無特異性癥狀,就診時大多已發展至腫瘤的中晚期,常規的手術切除治療難以清除病灶組織,術后需要輔以放化療來降低復發風險[2-3]。但長期大量使用化療藥物會殺傷機體正常細胞,引起骨髓抑制、肝腎毒性等,影響化療效果[4]。尋找一種輔助治療CRC的藥物來抑制腫瘤的增殖促進其凋亡尤為重要。羅哌卡因是一類酰胺類的新型局部麻醉藥,具有對心臟毒性小、麻醉時間長等優點[5]。Qin等[6]研究表明,羅哌卡因可以抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、侵襲及遷移,并促進其凋亡。高聰等[7]研究表明:羅哌卡因可以有效抑制結腸癌細胞增殖,但關于羅哌卡因誘導人結直腸SW620細胞株凋亡的機制研究尚不明確。因此本研究選擇從線粒體通路途徑探究羅哌卡因對人結直腸SW620細胞株凋亡的作用及可能的機制,旨在為CRC患者治療提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞

結直腸SW620細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

青霉素和鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司);RPMI1640培養基、胎牛血清(美國Hyelone公司);Bcl-2抗體(貨號:ab32124;批號:190807)、Bax抗體(貨號:ab32503;批號:191011)、Caspase-3抗體(貨號:ab13847;批號:190701)、Caspase-3抗體(貨號:ab32539;批號:190904)購自美國Abcam公司。離心機(型號:TGL-16M,濟南來寶醫療器械有限公司);流式細胞儀(型號:CytoFLE,美國貝克曼有限公司);細顯微鏡(型號:WMS-1037)購自上海無陌光學儀器有限公司;細胞培養箱(型號:ZSP-350S,上海左樂儀器有限公司);蛋白電泳及轉膜儀及相關系統(美國伯樂公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

將凍存的結直腸SW620細胞株接種于含質量分數為10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中,置于溫度為37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養過夜,當細胞生長融合至80%左右,加入胰蛋白酶進行消化,傳代培養。

1.3.2 CCK-8檢測細胞活性

當細胞在細胞培養箱中生長匯合率達到80%時將細胞傳代接種至24孔板中(每孔100 μL),使用不同濃度的羅哌卡因處理(1、5、10、20、50、100、200、400、800 μg/mL)放入溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養箱中培養24 h,待細胞貼壁后,分別培養0、1、2、3 d后加10 μL CCK-8溶液培養2 h后使用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光度值,計算結直腸SW620細胞的增長率。抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞膜電位及細胞周期和凋亡情況

取與相應藥物孵育至對數生長期的結直腸SW620細胞接種于24孔板內,采用PBS調整細胞濃度至每毫升6×105個,培養48 h后收集細胞,一部分放入流式細胞樣管中,使用離心機在2000 r/min的條件下離心5 min,棄上清,加入濃度為5 μg/mL的Rhodamine 200 μL避光孵育30 min,使用流式細胞儀分析結直腸SW620細胞的膜電位情況。另一部分加入200 μL質量分數為50 ng/L的PI和質量分數為20 ng/L的Nase A染液,在溫度為4℃避光條件下,共同孵育30 min,上用流式細胞儀分析結直腸SW620細胞周期及凋亡率情況。

1.3.4 Western blot檢測結直腸SW620細胞蛋白表達水平

取與相應藥物孵育至對數生長期的結直腸SW620細胞,離心(4℃,10 min),采用裂解液裂解后提取總蛋白。依次進行電泳、轉PVDF膜,加入質量分數為5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗Bcl-2,Bax,Caspase-3和Caspase-9抗體(稀釋比例均為1∶500),溫度為4℃條件下孵育過夜,加入二抗,常規孵育2 h,計算各蛋白相對內參蛋白為GADPH的表達水平。

1.4 統計學方法

采用軟件為GraphPad Prism5軟件作圖,采用軟件為SPSS 22.0軟件分析所有試驗數據,多組間比較使用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CCK-8檢測癌細胞活力結果

使用CCK-8實驗檢測使用不同濃度羅哌卡因處理后發現,當使用羅哌卡因濃度為10 μg/mL時,對結腸癌細胞的抑制率約為(92.01±4.00)%顯著低于使用哌卡因濃度為1 μg/mL時的抑制率(99.00±0.01)%;隨著使用羅哌卡因濃度增加,結腸癌細胞的抑制率逐漸降低(P<0.05),依據本實驗檢測結果顯示,結直腸癌SW620細胞的半數致死濃度約為69.36 μg/mL,見圖1。

圖1 CCK-8檢測癌細胞活力結果(n=24)Figure 1 Viability of cancer cells detected by CCK-8

2.2 羅哌卡因對人結直腸癌SW620細胞線粒體膜電位影響

檢測各組細胞線粒體膜電位發現,相比結直腸癌SW620細胞,低劑量羅哌卡因組細胞膜電位顯著降低(P<0.01);相比低劑量羅哌卡因組,中劑量羅哌卡因組細胞膜電位顯著降低(P<0.01);相比中劑量羅哌卡因組,高劑量羅哌卡因組細胞膜電位顯著降低(P<0.01),見圖2。

2.3 羅哌卡因對人結直腸癌SW620細胞周期及凋亡影響

檢測羅哌卡因對各組人結直腸癌SW620細胞周期及凋亡影響發現,相比結直腸癌細胞組,低劑量羅哌卡因組G0/G1期細胞比例和細胞凋亡率均顯著升高,G2/M期和S期細胞比例均顯著降低(P<0.01);相比低劑量羅哌卡因組,中劑量羅哌卡因組G0/G1期細胞比例和細胞凋亡率均顯著升高,G2/M期和S期細胞比例均顯著降低(P<0.01);相比中劑量羅哌卡因組,高劑量羅哌卡因組G0/G1期細胞比例和細胞凋亡率均顯著升高,G2/M期和S期細胞比例均顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 羅哌卡因對人結直腸癌SW620細胞周期及凋亡影響(ˉx±s,n=24)Table 1 Effects of ropivacaine on the cycle and apoptosis of human CRC cells

2.4 羅哌卡因對人結直腸癌SW620細胞凋亡蛋白表達影響

蛋白質印跡法檢測各組細胞凋亡蛋白發現,相比結直腸癌細胞組,低劑量羅哌卡因組Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達顯著升高,Bax蛋白表達顯著降低(P<0.01);相比低劑量羅哌卡因組,中劑量羅哌卡因組Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達顯著升高,Bax蛋白表達顯著降低(P<0.01);相比中劑量羅哌卡因組,高劑量羅哌卡因組Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達顯著升高,Bax蛋白表達顯著降低(P<0.01),見圖3和表2。

表2 羅哌卡因對人結直腸癌SW620細胞凋亡蛋白相對表達量影響(ˉx±s,n=24)Table 2 Effects of ropivacaine on the relative expression levels of apoptosis proteins in human CRC cells

注:與結直腸癌細胞組相比,??P<0.01;與低劑量羅哌卡因組相比,##P<0.01;與中劑量羅哌卡因組相比,&&P<0.01。圖2 羅哌卡因對人結直腸癌SW620細胞線粒體膜電位影響(n=24)Note.Compared with colorectal cancer cell group,??P<0.01.Compared with low-dose ropivacaine group,##P<0.01.Compared with medium-dose ropivacaine group,&&P<0.01.Figure 2 Effects of ropivacaine on MMP in human CRC cells

注:A:結直腸癌細胞組;B:低劑量羅哌卡因組;C:中劑量羅哌卡因組;D:高劑量羅哌卡因組。圖3 羅哌卡因對人結直腸癌SW620細胞凋亡蛋白表達影響(n=24)Note.A,CRC cell group.B,Low-dose ropivacaine group.C,Medium-dose ropivacaine group.D,High-dose ropivacaine group.Figure 3 Effects of ropivacaine on the expression of apoptosis proteins in human CRC cells

3 討論

細胞凋亡是指由基因調控的細胞自主性的程序性死亡,細胞主要通過細胞的凋亡調控內環境[8]。目前研究表明,細胞凋亡主要有3種途徑:Bcl-2/Bax介導的線粒體細胞凋亡通路、死亡受體途徑介導的細胞凋亡通路和內質網通路[9]。其中線粒體通路是目前研究的凋亡通路中最經典的凋亡通路。Baechler等[10]研究表明:線粒體通路途徑可通過改變線粒體膜通透性,引起細胞膜內外Ca2+平衡被打破,使得細胞膜內外出現電位差,當線粒體膜電位降低會導致線粒體呼吸(電子傳遞)加速,氧自由基生成增加,發生氧化應激反應使得細胞凋亡。因此本研究檢測了各組膜內外電位變化,發現相比結直腸癌細胞組,使用羅哌卡因各組細胞膜電位顯著降低。說明使用羅哌卡因可以改變線粒體膜通透性,導致膜內外Ca2+平衡被打破,降低細胞膜內電位,促進氧化應激反應誘導細胞凋亡。

線粒體通路途徑誘導細胞凋亡除了通過改變粒體膜通透性引起膜電位差外,還可以通過活化Caspase等蛋白酶家族,誘導凋亡相關因子的釋放等,引起細胞凋亡的級聯反應,最終導致細胞凋亡[11]。目前研究較多的細胞凋亡相關蛋白家族主要包括Caspase家族和Bcl-2家族。Caspase家族中Caspase-3是常見的啟動子,Caspase-9是常見的執行子[12]。當細胞接收到凋亡信號后會激活Caspase-3,促進Caspase-9自身裂解產生pro-Caspase-9,并反過來再次活化Caspase-3引發細胞凋亡的級聯反應[13]。除了Caspase家族,在Bcl-2家族中主要包括促凋亡基因Bcl-2和抑凋亡基因Bax[14]。本研究通過蛋白質印跡實驗發現,相比結直腸癌細胞組,使用羅哌卡因處理各組結直腸癌SW620細胞中Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白和Caspase-9蛋白相對表達水平升高,Bax蛋白表達下降。說明羅哌卡因處理可以激活Caspase家族中的凋啟動子并促進Bcl-2家族中的促凋亡基因的表達。王文婷等[15]研究表明:羅哌卡因作用結直腸癌SW620細胞后可以調節凋亡相關蛋白表達,誘導腫瘤細胞凋亡,本研究得出的結論與其相一致。

細胞周期可分為4個時相:G1、S、G2、M。其中G1期是DNA合前期,主要合成RNA和核糖體;G2期是DNA合成后期,主要是RNA和蛋白質的合成;M期是細胞裂期,所有細胞執行定物功能;S期是分裂期[16]。在細胞周期中每一個誤差都可能導致遺傳信息的改變[17]。本研究通過檢測細胞周期發現,相比結直腸癌細胞,使用羅哌卡因各組G0/G1期細胞比例和細胞凋亡率均顯著升高,G2/M期和S期細胞比例均顯著降低。姬寧寧等[18]研究表明:羅哌卡因可以通過阻滯細胞周期,抑制癌細胞的增殖。研究結果說明使用羅哌卡因可以有效將SW620細胞阻滯與G0/G1期,這可能是因為用羅哌卡因將阻滯了結直腸癌SW620細胞合成RNA和核糖體并使得細胞分裂所需的必要蛋白合成受阻導致癌細胞的增殖受到抑制。

綜上所述,羅哌卡因可以通過線粒體途徑促進人結直腸SW620細胞的凋亡,其作用機制可能與Caspase-3及Bcl-2信號傳導相關。