棱術排石顆粒對腎草酸鈣結石作用機制的研究

柯井衛朱永生唐 海劉 鑫賴俊諭劉 星

(西南醫科大學附屬中醫醫院泌尿外科,四川 瀘州 646000)

泌尿系結石在全球范圍內屬于高發病,不同國家或地區發病率存在差異,我國發病率大約為6%左右,而其中大約80%的泌尿系結石由草酸鈣組成[1]。泌尿系統結石是一個復雜的過程,目前的研究認為與飲食、地理、氣候、種族及遺傳等多種因素有關[2],但不同結石類型的發病機制尚未完全明確。隨著臨床上治療設備及技術的發展,采用沖擊波或其他外科手術等方法已經廣泛應用于泌尿系結石的治療。然而臨床中發現,上述治療手段治療腎結石的過程中往往不可避免的會引起創傷性損傷甚至嚴重影響腎功能,且治療后復發率可高達70%左右[3]。目前在藥物治療方面,磷酸纖維素鈉、正磷酸鹽及噻嗪類利尿藥等可應用于泌尿系結石治療及預防其復發,但臨床療效不能達到滿意效果,而且存在引起副作用的風險[4]。中草藥治療泌尿系統結石具有悠久的歷史,且在臨床中取得了一定的效果,作為無創治療方法其還具有副作用少、成本低廉等優點,被廣泛應用于泌尿系結石的治療及其研究中[5]。本研究探討中藥復方棱術排石顆粒對大鼠尿草酸鈣結石形成的作用機制進行初步探討,從而為臨床提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

12~13周齡的雄性SD大鼠32只,SPF級,體重200~220 g,購自西南醫科大學實驗動物中心[SCXK(川)2018-17],飼養在本單位的實驗動物中心[SYXK(川)2018-065],飼養室保持良好通風,飼養環境溫度為(25±2)℃,濕度(50±10)%,12 h循環光照。正常飼養1周以適應環境,第2周開始進行實驗,實驗過程中遵循3R原則。本實驗已通過西南醫科大學附屬中醫醫院動物倫理委員會審批批準(XNFS(A)-2019-062)。

1.2 主要試劑與儀器

棱術排石顆粒(藥方比例為:三棱200 g、川芎200 g、海金沙300 g、糊精700 g、莪術200 g、金錢草600 g、牽牛子(醋制)200 g、白芍300 g、川木通300 g、威靈仙300 g)有我院藥劑科提供;蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)特異性抑制劑R031-8220(EK-0514)采購自美國Selleck公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)濃度測定試劑盒(AE-0294)、3,3-二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)化學發光試劑盒(AE-29984)采購自Sigma公司;Vonkossa試 劑 盒(BK-29402)、丙二 醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(BT-019942)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒(BA-00032)購自上海碧云天生物技術公司;PKC(ab-03941)、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(epoxy chloropropane Kelch sample related protein-1,Keap1)(ab-23992)、結核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor2,Nrf2)(ab-12323),抗氧化反應元件(antioxidant response elements,ARE)抗體(ab-02994)、兔抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(ab-05132)以及山羊抗兔IgG(ab-08274)采購自美國abcam公司;2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸(2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)試劑盒(R-029442)、Western blot試劑盒(R-033245)購自德國Rebstock公司。

石蠟切片機(M2016,上海徠卡儀器有限公司,中國);全自動酶標儀(680型,伯樂公司,美國);電泳儀(DYY-6C,北京六一儀器廠,中國);凝膠成像系統(GelDoc XR+,伯樂公司,美國);分光光度計(Nanodrop 2000,賽默飛世爾公司,美國);實時熒光定量PCR儀(LightCycler96,羅氏公司,英國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 收集分析結石標本

經自行排石、外沖擊波碎石、經皮腎鏡碎石取石、開放性手術取石、輸尿管軟鏡或硬鏡下碎石取石、膀胱鏡下碎石取石、開放性手術取石等方式收集結石標本。結石成分通過傅立葉紅外光譜儀Turbo FT型(美國D&P)測定。

1.3.2 分組處理

大鼠適應性飼養1周后隨機分為4組,即:對照組、模型組、治療組和抑制劑組,每組8只。除對照組外,所有大鼠28 d內連續給予1%乙二醇及2%氯化銨誘導大鼠泌尿系草酸鈣結石形成[6],造模同時進行藥物處理,治療組灌胃給藥10.0 g/kg的棱術排石顆粒,抑制劑組在治療組基礎上腹腔注射30 mg/kg R031-8220,對照組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.3.3 尿液樣本收集及尿液指標分析

28 d后,用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液,測定24 h尿量、尿液pH值后,取2 mL尿液中加入0.5 mL濃硫酸,300 r/min離心10 min,采用原子吸收光密度法測定尿液中Ca2+、Mg2+含量。另去部分尿液采用高錳酸鉀法測定尿草酸(oxalic acid,Ox)分泌量。

1.3.4 血液生化指標檢測

收集尿液后,稱取大鼠重量并處死各組大鼠,下腔靜脈取血,3000 r/min離心10 min后取上血清,使用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine ratio,Cr)中Ca2+、Mg2+含量。

1.3.5 Vonkossa染色觀察病理學變化

左側腎用10%多聚甲醇固定后,常規石蠟包埋,經Vonkossa染色,制成切片,光鏡下觀察各組大鼠左側腎的病理改變。

1.3.6 DCFH-DA染色檢測各組大鼠腎組織中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)及與MDA、SOD酶的活性

取出各組大鼠的腎組織,冰凍切片,二甲苯浸洗兩次,添加10 μmol/L DCFH-DA染色2 h,熒光顯微鏡下拍照記錄,并用Image 8.0軟件分析圖像,注意所用染色劑要保證現用現配[7]。按照各試劑盒說明書要求操作,使用相應試劑盒檢測試劑盒來檢測細胞中MDA的含量和SOD活性。

1.3.7 Western blot檢測檢測各組大鼠腎組織PKC、Keap1、Nrf2、ARE的表達水平

取出各組大鼠左腎組織勻漿,冰上裂解30 min后,離心獲得上清,蛋白濃度采用BCA試劑盒測定,每個樣品取50 μg,然后進行SDS-PAGE電泳、PVDF轉膜、TBST液封閉,維持4℃過夜孕育,后分別加入一抗(PKC、Keap1、Nrf2、ARE)(1∶1500),孕育1 h,洗滌加入抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶10000),加入ECL顯色30 min,以GAPDH作為內參表示蛋白相對表達水平。

1.4 統計學方法

數據分析采用軟件SPSS 16.0,符合正態分布的計量資料采用平均數±標準差(ˉx±s)進行表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05表示差異顯著,具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠尿液指標的比較

各組大鼠尿液生化指標如表1所示,與對照組相比,模型組大鼠24 h尿量、尿pH、Mg2+明顯降低,Ox、Ca2+水平明顯升高(P<0.05);經棱術排石顆粒治療后,與模型組相比,治療組大鼠24 h尿量、尿pH、Mg2+明顯升高,Ox、Ca2+水平明顯降低(P<0.05);抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 棱術排石顆粒對草酸鈣結石大鼠尿液指標的影響(ˉx±s,n=8)Table 1 Effect of Riangzhipeishi granule on urine index of calcium oxalate calculi rats

2.2 各組大鼠血液生化指標比較

各組大鼠血液生化指標如表2所示,與對照組相比,模型組大鼠血清BUN、Cr、Ca2+水平明顯升高,Mg2+明顯降低(P<0.05);經棱術排石顆粒治療后,與模型組相比,治療組大鼠血清BUN、Cr水平明顯降低,Mg2+明顯升高(P<0.05);抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 棱術排石顆粒對草酸鈣結石大鼠血生化指標的影響(ˉx±s,n=8)Table 2 Effects of Riangzhipeishi granule on blood biochemical indexes of calcium oxalate calculi rats

2.3 Vonkossa染色檢測各組大鼠腎組織病理變化

Vonkossa染色結果如圖1所示,對照組大鼠腎表面光滑且富有彈性,色澤正常,其他組大鼠腎蒼白。對照組大鼠中腎內膜層細胞排列規整,內皮連續完整,無缺損現象出現。模型組大鼠腎中膜、內膜細胞排列紊亂,內皮凸起伴有大量淋巴細胞填充,腎皮質及腎乳頭內有草酸鈣沉積,手觸摸有明顯顆粒感;治療組大鼠腎中膜、內膜細胞排列較整齊,內皮輕微凸起少見淋巴細胞填充,腎皮質及腎乳頭內有少有草酸鈣沉積,手觸摸顆粒感不明顯;而抑制劑組大鼠腎病理變化與模型組相似。

2.4 各組大鼠腎MDA、SOD、ROS水平的比較

與對照組相比,模型組大鼠腎MDA水平、ROS熒光強度明顯增加,而SOD酶活性明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,治療組大鼠腎組織中MDA水平、ROS熒光強度明顯降低,而SOD酶活性明顯增強,差異具有統計學意義(P<0.05);抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05),見圖2,表3。

表3 各組大鼠腎組織MDA、SOD、ROS比較(ˉx±s,n=8)Table 3 Comparison of MDA,SOD and ROS in renal tissues of rats in each group

注:A:對照組;B:模型組;C:治療組;D:抑制劑組。下同。圖1 Vonkossa染色檢測各組大鼠腎組織病理變化Note.A,Control group.B,Model group.C,Treatment group.D,Inhibitor group.The same as below.Figure 1 Pathological changes of renal tissues of rats in each group detected by Vonkossa staining

圖2 各組大鼠腎組織ROS水平的檢測Figure 2 Detection of ROS levels in renal tissues of rats in each group

2.5 Western blot檢測各組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白的表達

與對照組相比,模型組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白表達量明顯升高,差異均具有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,治療組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白表達量明顯下降,差異均具有統計學意義(P<0.05),抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05),見圖3,表4。

表4 各組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白比較(ˉx±s,n=8)Table 4 Comparison of PKC,Keap1,Nrf2,and ARE proteins in renal tissues of rats in each group

圖3 各組大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白表達Figure 3 Protein expressions of PKC,Keap1,Nrf2,and ARE in renal tissues of rats in each group

3 討論

根據流行病學統計[7],泌尿系統結石的發病率逐年升高,且我國是世界上三大結石高發地之一,其中影響泌尿結石的最主要因素包括遺傳、代謝、飲食和地理因素。目前臨床診斷技術不斷進步,大多數尿路結石患者可根據結石成分分析及代謝評估確定發病原因,這對結石的預防及治療具有重要意義。本實驗室前期分析了1407例四川地區尿路結石患者的結石成分,結果顯示,尿路結石主要分布于上尿路,且92.11%的患者為草酸鈣結石,該結石的位置分部與成分組成與報道基本相符[8]。中藥在治療泌尿系統結石中取得了一定的療效,其中一經驗方制成的中成藥具有療效確切、價格低廉且副作用低等特點具有良好的應用前景。棱術排石顆粒是我院常用治療泌尿結石的藥物,特別是對于腎草酸鈣結石的治療取得了滿意的效果,但其作用機制尚無報道。

乙二醇作為草酸的前體物質,可引起腎小管上皮細胞損傷引起高草酸尿癥狀并最終導致腎結石的形成,氯化銨可降低尿液pH值,促進草酸鈣結晶的形成[9],本研究以乙二醇和氯化銨構建大鼠腎草酸鈣結石模型,結果顯示,模型組大鼠24 h尿量、尿pH、血清及尿中Mg2+降低,而尿Ox、血清腎功能指標BUN、Cr及血清和尿中Ca2+水平均明顯升高,草酸鈣結石的形成分為多個階段,包括晶核的形成、晶體成長、集聚和潴留等多個過程,Ca2+是結石形成的必要物質,草酸鈣結石以Ca2+升高為主要標志[10]。高Ox尿是草酸鈣結石形成的重要影響因子,Mg2+可絡合Ox,降低Ox的水平從而抑制草酸鈣結石的形成[11]。病理觀察顯示,模型大鼠腎組織中存在大量草酸鈣結晶,說明模型構建成功。經棱術排石顆粒治療后,上述指標及病理狀態均明顯改善,說明棱術排石顆粒可有效抑制腎草酸鈣結石的形成。

研究發現,長期的高水平草酸可促進腎組織的氧化應激反應,產生大量的ROS可損傷腎小管,增加了腎小管上皮細胞表面的黏附效應,促進了草酸鈣結石的形成[12]。現代藥理學研究表明,棱術排石顆粒中多種藥材中含有具抗氧化活性成分,其中三棱中總茋類物質不僅能夠清除活性氧,還可以抑制機體中氧自由基的生成以及抵抗脂質過氧化反應[13]。研究發現,川芎可以改變糖尿病腎病氧化應激水平改善病理狀態[14]。金錢草提取物能夠增加腎組織SOD水平,從而有效抑制結晶的形成[15]。本研究結果顯示,棱術排石顆粒治療后大鼠MDA水平明顯降低,SOD酶活明顯升高,說明棱術排石顆粒治療腎草酸鈣結石可能與改善氧化應激水平有關。PKC-Nrf2/ARE信號通路是重要的抗氧化防御性轉導通路[16]。正常狀態下,PKC介導的通路下游蛋白Nrf2與Keap1結合以二聚體的形式存在,而氧化應激刺激可使Keap1半胱氨酸殘基被修飾,從而使該二聚體發生解離,Nrf2進入細胞核與抗氧化應激原件ARE相互作用,從而發揮抗氧化的作用[17]。本研究結果顯示,經過棱術排石顆粒治療的腎草酸鈣結石大鼠腎組織中PKC、Keap1、Nrf2、ARE蛋白表達含量均明顯升高,說明棱術排石顆粒治療的腎草酸鈣結石可能是通過激活PKC-Nrf2/ARE抗氧化信號通路達到治療效果。

綜上所述,棱術排石顆粒可有效改善腎草酸鈣結石大鼠的病理狀態,其機制可能與激活PKCNrf2/ARE抗氧化信號通路降低氧化應激水有關。