miR-433-3p通過調控MAPK8蛋白在H2 O2誘導的心肌細胞損傷中發揮保護作用

盛靜宇朱海根?王 麗

(1.江蘇大學附屬武進醫院 徐州醫科大學武進臨床學院心電學科,江蘇 常州 213000;2.江蘇大學附屬武進醫院 徐州醫科大學武進臨床學院全科醫學科,江蘇 常州 213000;3.常州德安醫院院感科,江蘇 常州 213000)

心血管疾病作為全球發病率和死亡率最高的疾病給患者健康帶來了嚴重的挑戰[1]。據目前研究所知,心血管疾病潛在的病理變化主要包括心臟衰竭、心肌梗死、心房顫動、動脈粥樣硬化和缺血再灌注[2]。值得注意的是,心肌梗死是威脅人類健康和導致心肌細胞死亡的主要因素之一[3]。研究發現,在心肌梗死的過程中,心肌細胞會在相當長的一段時間內遭受缺血缺氧導致的不可逆轉的細胞死亡或心功能不全[4]。減少心肌細胞凋亡和損傷可以明顯改善心功能和心臟重構。因此,保護心肌細胞凋亡在抑制心血管疾病的發展過程中發揮著極其關鍵的作用。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類長度約為18~24個核苷酸的內源性非編碼RNA分子,可以通過靶向結合含有部分互補序列的mRNA的3’非編碼區(3’UTR)端而對mRNA進行轉錄后水平調控,進而影響細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學功能[5-7]。越來越多的研究表明miRNAs在多種心臟疾病中發揮重要作用[8-10]。miR-433-3p是位于12號染色體上的抑癌基因,可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和耐藥[11-12]。除腫瘤細胞外,心肌中miR-433-3p可以通過靶向調節有絲分裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)影響心肌纖維化的進程[13]。但miR-433-4p是否能夠通過MAPK8調控在心血管疾病中發揮作用還尚未報道。在本研究中,我們將心肌細胞H9c2暴露于過氧化氫(H2O2)刺激中以模擬氧化應激引起的心肌損傷,并探討miR-433-3p在H2O2誘導的大鼠心肌細胞H9c2損傷中的作用及潛在機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

大鼠心肌細胞H9c2購買于中科院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養基(批號:A4192101)、胎牛血清FBS(批號:15140163)、青霉素和鏈霉素(批號:15140-122)(美國Gibco公司);MTT檢測試劑盒(批號:ST316)、乳酸脫氫酶ELISA活性檢測試劑盒(批號:C0016);全蛋白提取試劑盒(批號:P0033)、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(批號:P0012S)(上海碧云天生物公司);miR-433-3p模擬物miR-433-3p mimics、miRNA陰性對照miRNC、MAPK8過表達載體pcDNA-MAPK8、陰性對照pcDNA-NC(上海吉瑪制藥有限公司);Bcl-2抗體(批號:2875)、Bax抗體(批號:14796)、Caspase-3抗體(批號:9662)、Cealve Caspase-3抗體(批號:9661)、MAPK8抗體(批號:9255)、GAPDH抗體(批號:5174)、羊抗兔二抗(批號:2985S)(美國Cell Signaling Technology公司);SYBR Green qPCR試劑盒(批號:RR420A)(大連TaKaRa公司);轉染試劑脂質體Lipofectamine 2000(批號:11668027)(美國Invitrogen公司);雙熒光素酶檢測試劑盒(批號:C8304)(美國Promega公司);酶標儀(批號:MB16-414)(上海皓莊儀器公司);倒置相差顯微鏡(批號:STM7)(日本奧林巴斯公司);蛋白凝膠成像儀(批號:Bio6000)(中晶有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養和處理

將H9c2細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中。細胞在37℃、95%空氣和5% CO2的細胞培養箱中孵育。每48 h更換一次培養基。當細胞融合度達到90%以上時進行傳代培養。取對數生長期細胞進行后續實驗。將對數生長期的H9c2細胞按照每毫升3×103個的密度接種于96孔板24 h后,分別加入0、25、50、100、200 μmol/L的H2O2繼續培養24 h。采用MTT法檢測H2O2對心肌細胞H9c2活力的影響并篩選出最合適的H2O2濃度。

1.3.2 細胞轉染及分組

當H9c2細胞生長密度達到80%時用胰蛋白酶消化細胞,并按照每毫升2×105個的密度將細胞接種到6孔板中。待細胞生長密度達到70%時,用200 μmol/L的H2O2處理24 h。隨后采用Lipofectamine 2000將miR-NC(miRNA陰性對照組),miR-433-3p mimics(miR-433-3p模擬物組),miR-433-3p mimics與pcDNA-NC(miR-433-3p模擬物+pcDNA陰性對照組),miR-433-3p mimics與pcDNA-MAPK8(miR-433-3p模擬物+MAPK8過表達組)轉染至細胞。轉染6 h后更換完全培養基并繼續培養48 h,以備后續實驗。

1.3.3 MTT法檢測細胞活力

取轉染48 h后的H9c2細胞按照每毫升1×104個的密度接種于96孔板中。常規培養24、48、72 h后。每孔加入終濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL,孵育4 h后倒掉上清,加入150 μL的二甲基亞砜室溫孵育10 min。采用全自動酶標儀在570 nm時檢測各孔的OD值。

1.3.4 ELISA檢測LDH水平

根據1.3.2的方法對細胞進行分組后,嚴格按照ELISA試劑盒的操作說明檢測H9c2細胞培養液中的LDH水平。

1.3.5 qRT-PCR檢測miR-433-3p和MAPK8的表達水平

收集各組細胞,用PBS清洗細胞后,采用TRIzol溶液提取RNA后逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板嚴格按照SYBR Green qPCR試劑盒標準說明書分別進行目的基因的熒光定量PCR擴增。反應條件:95℃預變性5 min,95℃變性15 s,60℃退火30 s,共計45個循。以GAPDH或U6作為內參并采用2-△△Ct法計算miR-433-3p和MAPK8的相對表達量。其中所使用的引物詳見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.6 Western blot法檢測相關蛋白表達水平

收集各組細胞,用PBS清洗細胞后,采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA濃度檢測試劑盒對蛋白提取物進行定量。每孔20 μg上樣量,通過12% SDS-PAGE分離蛋白,將蛋白印跡轉移到PVDF膜,用5%脫脂奶封膜2 h,加入標記一抗4℃孵育過夜,PBS清洗PVDF膜后在加入標記二抗孵育1 h。加ECL顯影液進行顯影。以GAPDH作為內參。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗

采用miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)網站預測miR-433-3p和MAPK8的靶向作用位點。構建野生型和突變型的MAPK8 3’UTR區域的重組質粒,分別與miR-433-3p或miR-NC共轉染至H9c2細胞。48 h后嚴格按照雙熒光素酶檢測試劑盒檢測細胞中熒光素酶的活性。

1.4 統計學方法

采用統計學分析軟件SPSS 18.0分析實驗結果。所有實驗數據均采用平均數±標準差(ˉx±s)表示。兩組之間比較采用t檢驗,多組之間比較采用單因素方差分析。P<0.05被認為差異顯著,具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-433-3p在H2O2誘導的心肌細胞H9c2中低表達

采用H2O2構建心肌細胞氧化應激損傷模型。0、25、50、100、200 μmol/L的H2O2處理H9c2細胞48 h后,MTT檢測結果顯示,相對比對照組,隨著H2O2濃度的增加,H9c2細胞活力逐漸減少,且有顯著性差異(P<0.001,圖1A)。在H2O2濃度為200 μmol/L時,細胞活力下降為初始值的50%。因此選擇該濃度作為后續實驗研究的H2O2誘導劑量。接下來,我們采用qRT-PCR法檢測miR-433-3p在H9c2細胞中的mRNA表達水平,H2O2組miR-433-3p表達水平比對照組顯著減少;與H2O2+miR-NC組相比,轉染了miR-433-3p mimics的細胞中miR-433-3p表達水平顯著升高(P<0.01,圖1B)。表明miR-433-3p過表達質粒構建成功。

2.2 miR-433-3p過表達減輕了H2O2誘導的心肌細胞H9c2活性損傷

注:A:MTT檢測不同劑量的H2O2對H9c2細胞活力的影響;B:qRT-PCR檢測H2O2處理下的H9c2細胞中miR-433-3p表達水平的變化。1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miRNC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組。與0 μmol/L組比,???P<0.001;與對照組比較,###P<0.001;與H2O2+miR-NC組比較,ΔΔP<0.01。圖1 miR-433-3p在H2O2誘導的心肌細胞H9c2中低表達Note.A,Cell viabilities of H9c2 cells exposed to different doses of H2O2weredeterminedwith MTT assay.B,Levelsof miR-433-3p in H9c2 cells treated with H2O2 were detected by qRT-PCR.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.Compared with 0 μmol/L group,???P<0.001.Compared with control group,###P<0.001.Compared with H2O2+miR-NC group,ΔΔP<0.01.Figure 1 Level of miR-433-3p was downregulated in H9c2 cardiomyocytes treated with H2O2

與對照組相比,H2O2組H9c2細胞中的LDH釋放量顯著升高;與H2O2+miR-NC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics組H9c2細胞中的LDH釋放量顯著降低(均P<0.001,圖2A)。與對照組相比,H2O2組的H9c2細胞活性顯著降低;與H2O2+miRNC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics組的H9c2細胞活性顯著升高(均P<0.01,圖2B)。以上實驗結果表明在H2O2誘導的心肌細胞中miR-433-3p過表達可以明顯減輕細胞活性損傷。

2.3 miR-433-3p過表達抑制了H2O2誘導的心肌細胞H9c2凋亡

與對照組相比,H2O2組H9c2細胞中促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達水平顯著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著降低;與H2O2+miRNC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics組H9c2細胞中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著降低,Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.01,圖3)。以上實驗結果表明miR-433-3p過表達抑制了H2O2誘導的心肌細胞H9c2凋亡。

2.4 miR-433-3p負靶向調控MAPK8的表達

通過miRDB在線生物信息網站分析,miR-433-3p可以與MAPK8的3’UTR相結合。雙熒光素酶報告基因實驗表明在MAPK8野生型表達的H9c2細胞中,與miR-NC組相比,miR-433-3p mimics組的熒光素酶活性顯著下降(P<0.001,圖4A)。與miRNC組相比,miR-433-3p過表達能顯著抑制MAPK8的mRNA表達水平(P<0.001,圖4B)。與miR-NC組相比,miR-433-3p過表達能顯著抑制MAPK8的蛋白表達水平(P<0.001,圖4C)。

注:A:ELISA檢測miR-433-3p過表達對H2O2誘導下的H9c2細胞內LDH釋放量的影響;B:MTT檢測miR-433-3p過表達對H2O2誘導下的H9c2細胞活性的影響。1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miR-NC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組。與對照組比較,??P<0.01,???P<0.001;與H2O2+miR-NC組比較,##P<0.01,###P<0.001。圖2 miR-433-3p過表達減輕了H2O2誘導的心肌細胞H9c2活性損傷Note.A,Effect of miR-433-3p overexpression on the release of LDH in H9c2 cells treated with H2O2 was analyzed by ELISA assay.B,Effect of miR-433-3p overexpression on the viability of H9c2 cells treated with H2O2 was examined by MTT assay.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.Compared with control group,??P<0.01,???P<0.001.Compared with H2O2+miR-NC group,##P<0.01,###P<0.001.Figure 2 miR-433-3p overexpression attenuated H2O2-induced activity damage in H9c2 cardiomyocytes

2.5 過表達MAPK8可逆轉miR-433-3p過表達對H2O2誘導的心肌細胞H9c2活性損傷的保護作用

在H2O2誘導的H9c2細胞中過表達MAPK8,與對照組相比,過表達MAPK8組中MAPK8蛋白表達水平顯著升高(P<0.01,圖5A)。與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNAMAPK8組中的LDH釋放量顯著升高(P<0.01,圖5B)。與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNANC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNAMAPK8組中的細胞活性顯著下降(P<0.01,圖5C)。這些實驗結果表明過表達MAPK8可逆轉miR-433-3p過表達對H2O2誘導的心肌細胞H9c2損傷的保護作用。

2.6 過表達MAPK8可逆轉miR-433-3p過表達對H2O2誘導的心肌細胞H9c2凋亡的抑制作用

與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8組H9c2細胞中促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase3的表達水平顯著升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著降低(P<0.01,圖6)。這些實驗結果表明過表達MAPK8可逆轉miR-433-3p過表達對H2O2誘導的心肌細胞H9c2凋亡的抑制作用。

注:1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miR-NC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組。與對照組比較,??P<0.01;與H2O2+miR-NC組比較,##P<0.01。圖3 miR-433-3p過表達抑制了H2O2誘導的心肌細胞H9c2凋亡Note.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.Compared with control group,??P<0.01.Compared with H2O2+miR-NC group,##P<0.01.Figure 3 miR-433-3p overexpression inhibited the apoptosis of H9c2 cells treated with H2O2

注:A:雙熒光素酶報告基因檢測miR-433-3p和MAPK8之間的關系;B:qRT-PCR檢測miR-433-3p過表達對MAPK8蛋白水平的影響;C:Western blot檢測miR-433-3p過表達對MAPK8 mRNA水平的影響。與miR-NC組比較,???P<0.001。圖4 miR-433-3p負靶向調控MAPK8的表達Note.A,Relationship between miR-433-3p and MAPK8 was deteced by luciferase reporter assay.B,Effect of miR-433-3p overexpression on MAPK8 protein level was examined by qRT-PCR.C,Effect of miR-433-3p overexpression on MAPK8 mRNA level was observed by Western blot.Compared with miR-NC group,???P<0.001.Figure 4 Expression of MAPK8 was negatively regulated by miR-433-3p

注:1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miR-NC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組;5:H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組;6:H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8組。與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNANC組比較,?P<0.05。圖6 過表達MAPK8可逆轉miR-433-3p過表達對H2O2誘導的心肌細胞H9c2凋亡的抑制作用Note.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.5,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC group.6,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8 group.Compared with H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC group,?P<0.05.Figure 6 Overexpression of MAPK8 reversed the protective effect of miR-433-3p overexpression on apoptosis of H9c2 cells treated with H2O2

注:A:Western blot檢測MAPK8過表達質粒轉染效率;B:ELISA檢測過表達MAPK8對H2O2誘導下的H9c2細胞內LDH釋放量的影響;C:MTT檢測過表達MAPK8對H2O2誘導下的H9c2細胞活性的影響。1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miR-NC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組;5:H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組;6:H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8組。與pcDNA-NC組比較,??P<0.01;與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組比較,##P<0.01。圖5 過表達MAPK8可逆轉miR-433-3p過表達對H2O2誘導的心肌細胞H9c2活性損傷的保護作用Note.A,Transfection efficiency of MAPK8 overexpression plasmid was detected by western blot analysis.B,Effect of overexpression of MAPK8 on the release of LDH in H9c2 cells treated with H2O2 was analyzed by ELISA assay.C,Effect of overexpression of MAPK8 on the viability of H9c2 cells treated with H2O2 was examined by MTT assay.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.5,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC group.6,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8 group.Compared with pcDNA-NC group,??P<0.01.Compared with H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC group,##P<0.01.Figure 5 Overexpression of MAPK8 reversed the protective effect of miR-433-3p overexpression on the activity damage of H9c2 cells treated with H2O2

3 討論

研究表明H2O2誘導的多個基因的表達變化與心肌細胞損傷密切相關[14-16]。但H2O2誘導心肌細胞損傷過程中的基因調控目前還尚不清楚。MicroRNA是一種內源性的小編碼RNA,可以通過與靶基因的3’UTR相結合,在轉錄后調節靶基因的表達進而導致翻譯抑制或靶基因的降解[17-18]。心血管系統疾病是人類發病率和死亡率的主要原因且預后較差,目前由于心肌損傷診斷僅局限在常規心電圖、血清特異性敏感因子(如心肌酶、心肌肌鈣蛋白等)等有限手段,因此發現新的心肌損傷生物標志物和治療手段顯得尤為重要。一些研究表明,miRNAs不僅在心血管發育中發揮重要作用,而且在心臟肥厚、心力衰竭、缺血性心臟病等心血管疾病中也發揮重要作用[19-22]。MiR-433-3p通常作為抑癌基因在人類腫瘤的發生和發展中發揮著不同功能[12,23-24]。據報道,miR-433-3p在胃癌[25]、非酒精性脂肪肝炎患者內臟脂肪組織[26]和乙型肝炎病毒相關肝細胞癌中表達下調[27]。此外,miR-433能夠負靶向調節宮頸癌HeLa細胞中負責5-氟尿嘧啶敏感性的胸苷酸合成酶[28]。在心肌中miR-433-3p通過靶向調節MAPK8從而影響心肌纖維化的過程[13]。然而,miR-433-3p在心血管疾病中的研究尚未有過相關報道。在本研究中,我們發現在H2O2處理心肌細胞24 h后,細胞活性呈劑量依賴性的下降。且相比較對照組,miR-433-3p的表達水平在H2O2處理的心肌細胞H9c2中顯著下降。預示了miR-433-3p可能參與H2O2誘導的心肌細胞損傷過程。但miR-433-3p在H2O2誘導的心肌細胞損傷中的具體作用和機制還有待研究。

心肌缺血后,心肌細胞膜外出現大量損傷標志物的外漏。其中乳酸脫氫酶(LDH)被認為是最能反映出心肌損傷程度的重要分子,通過LDH水平的檢測可以有效反映出心肌損傷的程度[29]。此外,由于H2O2被廣泛用于誘導不同細胞類型的凋亡反應,而心肌細胞H9c2也常被用于研究心肌細胞凋亡[30]。也有相關研究顯示氧化應激和細胞凋亡與心血管疾病密切相關。例如,miR-1會影響H9c2心肌細胞的抗氧化應激和抗凋亡能力[31]。因此我們繼續探討了miR-433-3p對H2O2誘導的心肌細胞H9c2凋亡的作用。在本研究中,我們發現H2O2能顯著增強H9c2細胞中的LDH的水平,并誘導促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達水平的升高和抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平的下降進而促進細胞凋亡。而miR-433-3p過表達可以抑制由H2O2誘導的LDH水平上升和細胞凋亡,有效改善心肌細胞H9c2的損傷。

有絲分裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)是一類在多種細胞中扮演著重要調控作用的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。它在影響細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化、細胞死亡和炎癥等病理過程中發揮著重要的生物學作用[32-33]。在心肌損傷中,miR-190可以通過調節MAPK8/ERK信號通路保護心肌細胞H9c2免受H2O2誘導的凋亡[34]。此外,miR-433-3p可以通過靶向調節MAPK8影響心肌纖維化的進程[13]。因此,我們推測miR-433-3p可能通過靶向MAPK8影響心肌細胞的損傷和凋亡。在本研究,我們發現miR-433-3p可以負靶向調控MAPK8。過表達MAPK8可以逆轉miR-433-3p過表達對H2O2誘導的心肌細胞活性損傷和凋亡的保護作用?？傊?在H2O2誘導的H9c2細胞活性損傷和凋亡中miR-433-3p可以通過靶向調控MAPK8發揮保護作用。

綜上所述,miR-433-3p在H2O2誘導的心肌細胞H9c2中低表達,并能通過直接靶向MAPK8減輕由H2O2誘導的氧化應激和細胞凋亡。這一研究成果將有助于闡明治療缺血性心肌損傷的信靶點。