紅景天苷對糖尿病足潰瘍大鼠Nrf2/Keap1信號通路及傷口愈合的影響

景 亮祁永章

(1.青海大學附屬醫院臨床藥學科,西寧 810000;2.青海大學附屬醫院整形門診,西寧 810000)

糖尿病足是糖尿病常見并發癥之一,可導致足部出現不同程度感染、潰瘍、壞疽,增加截肢風險,嚴重影響患者身心健康及生活質量[1-2]。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer,DFU)是極其難愈性潰瘍,且易反復發作,然而如何促進其創面愈合是至今困擾醫學界學者的難題之一[3]。紅景天苷(salidroside,Sal)是紅景天主要活性成分,具有消炎、鎮痛、抗疲勞、抗氧化及免疫調節等多種藥理作用[4],對糖尿病腎病大鼠[5]、胃潰瘍[6]等具有較好治療作用,但關于Sal對DFU的影響尚鮮有研究,基于此,本研究提出假說,Sal可能對DFU有一定治療作用。核轉錄因子E2相關因子2/Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Nuclear transcription factor-E2 related factor2/Kelch-like epichlorohydrin-related protein 1,Nrf2/Keap1)信號通路在氧化應激過程中起重要作用,研究報道Sal可通過調節Nrf2/Keap1通路對肝損傷具有保護作用[7],且Nrf2激動劑可治療糖尿病血管并發癥[8]。因此本研究通過建立DFU大鼠模型,擬探究Sal對DFU大鼠Nrf2/Keap1信號與傷口愈合的作用,初步揭示其藥理機制,為臨床DFU的治療提供理論基礎,帶來新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康SPF級SD雄性大鼠100只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司[SCXK(滬)2017-0011],體重200~210 g,于本院動物中心清潔級動物房飼養[SYXK(青)2017-0012],飼養條件:溫度設為21℃~25℃、濕度設為40%~60%,12 h/12 h光照/黑暗交替照明,保持飼料飲水供應充足,使大鼠自由飲水飲食。本研究動物實驗已經由本院動物實驗倫理委員會批準(P-SL-20180099)。實驗嚴格遵守動物實驗中的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

紅景天苷(Sal,貨號:SMB00072,純度≥95%)、鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(貨號:S0130,HPLC≥98%)購自Sigma-Aldrich公司;鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊(國藥準字H20103017,生產批號:20180124)購自北京協和藥廠;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒(貨號:20170401)、丙二醛(malonalde-hyde,MDA)含量檢測試劑盒(貨號:D799761-0050)購自上海生工生物工程股份有限公司;兔源anti-CD34一抗(貨號:ab81289)、兔源anti-Nrf2一抗(貨號:ab137550)、兔源anti-Keap1一抗(貨號:ab139729)、兔源anti-GAPDH一抗(貨號:ab181602),羊抗兔IgG二抗(貨號:ab205718)均購自英國Abcam公司;光學顯微鏡(型號IX75)購自日本奧林巴斯公司;酶標儀(型號MODEL550)購自美國Bio-Rad公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 DFU模型制備

參考文獻[9]并稍作修改制備DFU大鼠模型,所有造模大鼠均予以高糖高脂飼料喂養4周,一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg),1周后尾靜脈采血測得空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)≥16.7 mmol/L、體重無明顯降低者為糖尿病模型制備成功。成模2周后大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,于足背部消毒后用印章標記面積約為3 mm×7 mm的標記,創面除毛剪皮至筋膜,醫用紗布覆蓋后,包扎固定,另取16只正常飼料喂養大鼠腹腔注射等量生理鹽水并進行足背部脫毛進行創面造模處理。

1.3.2 分組及給藥方法

成模大鼠隨機分為DFU模型組(DFU組)、Sal低(Sal-L)、中(Sal-M)高(Sal-H)劑量組,陽性藥物二甲雙胍組(MET組),另設正常飼料喂養腹腔注射生理鹽水并創面造模大鼠為正常對照組(NC組),每組各16只。Sal-L、Sal-M、Sal-H組分別給予Sal 0.1 g/kg、0.2 g/kg、0.3 g/kg,所選劑量參考文獻[10]并稍作修改,MET組給予MET 0.65 g/kg,NC組、DFU組給予等量生理鹽水,每天1次,連續灌胃14 d。

1.3.3 體重及FBG水平測定

分別于治療第0天、第7天、第14天測定各組大鼠體重變化,并尾尖采血,采用血糖監測儀監測空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)。

1.3.4 創面愈合率檢測

干預治療7 d、14 d后,肉眼觀察各組大鼠創面愈合情況,并將帶有網格的透明膜貼于創面處,采用掃描儀及Adobe photoshop CS6軟件分析定量創面面積,計算創面愈合率=(造模時創面面積-治療結束后創面面積)/造模時創面面積×100%。

1.3.5 創面組織MVD檢測

干預治療7 d、14 d后,各組大鼠分別隨機抽取8只,2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死大鼠,取創面組織制備石蠟切片,常規脫蠟至水采用免疫組化(SP染色)法檢測創面組織CD34陽性表達情況。石蠟切片經內源性酶滅活、抗原修復、封閉后依次添加anti-CD34抗體(1∶200)及IgG(1∶5000)抗體孵育,PBS洗滌后DBA顯色。蘇木素復染、脫水、透明,封片,顯微鏡下觀察。細胞質出現棕褐色顆粒為陽性細胞,10倍鏡視野下選取微血管密集度區,40倍鏡視野下計數所有微血管。采用MetaMorph-LCI型圖像分析系統,分析創面組織MVD[11]。

1.3.6 創面組織中氧化應激相關指標檢測

干預治療7 d、14 d后,每組各選取8只大鼠,勻漿制備大鼠創面組織樣品液,采用試劑盒通過生物化學法測定MDA及SOD活性水平,具體步驟參照其說明書指導進行。

1.3.7 創面組織中Nrf2、Keap1蛋白表達檢測

采用免疫印跡(Western blot)法分別檢測各組大鼠(與1.3.6共用8只大鼠)治療7 d、14 d后創面組織中Nrf2、Keap1蛋白表達情況。采用試劑盒提取各組大鼠創面組織總蛋白后通過BCA法測定其濃度,具體步驟參照各自說明書指導進行,保存在-80℃備用。蛋白樣品上樣后,以SDS-PAGE電泳進行分離,接著采用濕轉實驗將分離后的蛋白轉移至PVDF膜,37.5℃下封閉,添加兔源anti-Nrf2一抗(稀釋比例為1:1000)、兔源anti-Keap1一抗(稀釋比例為1∶1000)、兔源anti-GAPDH一抗(稀釋比例為1∶5000),4℃冰箱中孵育12 h,TBST緩沖液洗膜,添加羊抗兔二抗IgG(稀釋比例為1∶5000)于37.5℃下孵育,TBST緩沖液洗膜后顯色、曝片、拍照,觀察結果并運用Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.4 統計學方法

實驗數據都為計量資料,以平均數±標準差(ˉx±s)表示,并運用SPSS 25.0軟件進行統計分析。多組間比較行單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體重、FBG水平比較

治療第0天各組大鼠體重之間比較無統計學意義(P>0.05),各組DFU組、Sal-L組、Sal-M組、Sal-H組、MET組大鼠FBG水平均高于NC組(P<0.05);治療7 d、14 d,DFU組、Sal-L組、Sal-M組、Sal-H組、MET組大鼠體重、FBG水平均高于NC組(P<0.05);與DFU組比較,Sal-L組、Sal-M組、Sal-H組、MET組大鼠體重、FBG水平均顯著降低(P<0.05),其中Sal-L組與MET組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠體重、FBG水平比較Figure 1 Comparison of body weight and FBG level of rats in each group

圖2 各組大鼠FBG水平比較Figure 2 Comparison of FBG level of rats in each group

2.2 各組大鼠創面愈合率比較

治療7 d、14 d,DFU組、Sal-L組、Sal-M組、Sal-H組、MET組大鼠創面愈合率均低于NC組(P<0.05);與DFU組比較,Sal-L組、Sal-M組、Sal-H組、MET組大鼠創面愈合率顯著增加(P<0.05),其中Sal-L組與MET組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.3 各組大鼠創面組織MVD比較

注:與NC組比較,aP<0.05;與DFU組比較,bP<0.05;與MET組比較,cP<0.05;與Sal-L組比較,dP<0.05;與Sal-M組比較,eP<0.05。圖3 各組大鼠創面愈合率比較Note.Compared with NC group,aP<0.05.Compared with DFU group,bP<0.05.Compared with MET group,cP<0.05.Compared with Sal-L group,dP<0.05.Compared with Sal-M group,eP<0.05.Figure 3 Comparison of wound healing rate of rats in each group

治療7 d、14 d,與NC組比較,DFU組大鼠創面組織CD34陽性細胞及MVD顯著降低(P<0.05);與DFU組比較,Sal-L組、Sal-M組、Sal-H組、MET組大鼠創面組織CD34陽性細胞及MVD顯著增加(P<0.05),其中Sal-L組與MET組差異無統計學意義(P>0.05),見圖4,圖5,圖6。

注:與NC組比較,aP<0.05;與DFU組比較,bP<0.05;與MET組比較,cP<0.05;與Sal-L組比較,dP<0.05;與Sal-M組比較,eP<0.05。圖4 各組大鼠創面組織MVD比較Note.Compared with NC group,aP<0.05.Compared with DFU group,bP<0.05.Compared with MET group,cP<0.05.Compared with Sal-L group,dP<0.05.Compared with Sal-M group,eP<0.05.Figure 4 Comparison of MVD in wound tissue of rats in each group

注:A:NC組;B:DFU組;C:MET組;D:Sal-L組;E:Sal-M組;F:Sal-H組。圖5 各組大鼠7 d創面組織微血管CD34蛋白表達比較Note.A,NC group.B,DFU group.C,MET group.D,Sal-L group.E,Sal-M group.F,Sal-H group.Figure 5 Comparison of CD34 protein expression in microvessels of wound tissues of rats in each group on day 7

2.4 各組大鼠創面組織氧化應激相關指標比較

治療7 d、14 d,與NC組比較,DFU組大鼠創面組織MDA含量顯著升高(P<0.05),SOD活性顯著降低(P<0.05);與DFU組比較,Sal-L組、Sal-M組、Sal-H組、MET組大鼠創面組織MDA含量顯著降低(P<0.05),SOD活性顯著增加(P<0.05),其中Sal-L組與MET組差異無統計學意義(P>0.05),詳見圖7、圖8。

2.5 各組大鼠創面組織中Nrf2、Keap1蛋白表達量比較

治療7 d、14 d,與NC組比較,DFU組大鼠創面組織中Nrf2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)、Keap1蛋白表達量升高(P<0.05);與DFU組比較,Sal-L組、Sal-M組、Sal-H組、MET組大鼠創面組織Nrf2蛋白表達量顯著增加(P<0.05),Keap1蛋白表達量顯著降低(P<0.05),其中Sal-L組與MET組差異無統計學意義(P>0.05),詳見圖9、圖10、圖11。

注:與NC組比較,aP<0.05;與DFU組比較,bP<0.05;與MET組比較,cP<0.05;與Sal-L組比較,dP<0.05;與Sal-M組比較,eP<0.05。圖7 各組大鼠創面組織氧化應激相關指標(MDA)比較Note.Compared with NC group,aP<0.05.Compared with DFU group,bP<0.05.Compared with MET group,cP<0.05.Compared with Sal-L group,dP<0.05.Compared with Sal-M group,eP<0.05.Figure 7 Comparison of oxidative stress related indexes in wound tissue of rats in each group(MDA)

注:A:NC組;B:DFU組;C:MET組;D:Sal-L組;E:Sal-M組;F:Sal-H組。圖6 各組大鼠14 d創面組織微血管CD34蛋白表達比較Note.A,NC group.B,DFU group.C,MET group.D,Sal-L group.E,Sal-M group.F,Sal-H group.Figure 6 Comparison of CD34 protein expression in microvascular tissue of 14 days in rats of each group

注:與NC組比較,aP<0.05;與DFU組比較,bP<0.05;與MET組比較,cP<0.05;與Sal-L組比較,dP<0.05;與Sal-M組比較,eP<0.05。圖8 各組大鼠創面組織氧化應激相關指標(SOD)比較Note.Compared with NC group,aP<0.05.Compared with DFU group,bP<0.05.Compared with MET group,cP<0.05.Compared with Sal-L group,dP<0.05.Compared with Sal-M group,eP<0.05.Figure 8 Comparison of oxidative stress related indexes in wound tissue of rats in each group(SOD)

圖9 Western blot檢測大鼠創面組織中Nrf2、Keap1蛋白表達Figure 9 Expression of Nrf2 and Keap1 protein in wound tissue was detected by Western blot

注:與NC組比較,aP<0.05;與DFU組比較,bP<0.05;與MET組比較,cP<0.05;與Sal-L組比較,dP<0.05;與Sal-M組比較,eP<0.05。圖10 各組大鼠創面組織中Nrf2蛋白表達量比較Note.Compared with NC group,aP<0.05.Compared with DFU group,bP<0.05.Compared with MET group,cP<0.05.Compared with Sal-L group,dP<0.05.Compared with Sal-M group,eP<0.05.Figure 10 Comparison of Nrf2 protein expression in wound tissue of rats in each group

注:與NC組比較,aP<0.05;與DFU組比較,bP<0.05;與MET組比較,cP<0.05;與Sal-L組比較,dP<0.05;與Sal-M組比較,eP<0.05。圖11 各組大鼠創面組織中Keap1蛋白表達量比較Note.Compared with NC group,aP<0.05.Compared with DFU group,bP<0.05.Compared with MET group,cP<0.05.Compared with Sal-L group,dP<0.05.Compared with Sal-M group,eP<0.05.Figure 11 Comparison of Keap1 protein expression in wound tissue of rats in each group

3 討論

慢性潰瘍創面愈合是多種因素共同作用的結果,新生血管可為創面愈合提供血氧供應,其生成多少及快慢可影響DFU創面愈合,創面難愈與肉芽組織生長期氣虛血瘀有關。中醫理論亦認為,DFU屬“脫疽”、“消渴”范疇,該病主要病機為毒瘀阻絡,因此治療DFU重在清熱解毒、活血化瘀、去腐生肌,活血通脈[11]。Sal是傳統中藥紅景天主要活性成分之一,現代醫學研究發現,Sal具有抗氧化[12]、抗細胞損傷、抗腫瘤等多種生物作用[13]。韓靜等[14]研究報道,Sal可促進腦組織內源性神經再生,增加腦內神經營養因子表達,改善腦缺血損傷的神經行為學癥狀。趙紅姝等[15]研究報道,高山紅景天組方口服可降低糖尿病大鼠視網膜血管內皮生長因子表達,減少血管增生。候丹等[16]研究報道,Sal可能通過增加Nrf2、HO-1等蛋白表達,抑制氧化應激,改善糖尿病大鼠肝糖脂水平。因此本課題組推測,Sal可能對DFU創面愈合有一定積極作用。本研究首先建立DFU大鼠模型,結果發現,與NC組比較,DFU組、Sal-L組、Sal-M組、Sal-H組、MET組大鼠體質量、FBG水平均顯著升高,提示模型制備成功。經Sal治療后,DFU大鼠FBG水平顯著降低,創面組織愈合率、CD34陽性細胞及MVD顯著增加,提示Sal可降低DFU大鼠血糖水平,促進血管新生,促進DFU創面愈合。

DFU大鼠持續高糖狀態可誘導機體活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量增多,產生氧化應激,引起胰島素β細胞損傷,轉而加重病情,形成惡性循環,潰瘍經久不愈。Nrf2/Keap1是機體抗氧化損傷的關鍵信號通路,其中Nrf2是重要抗氧化因子,可通過核轉位進入細胞核與氧化反應元件(antioxidant responsive element,ARE)啟動HO-1、SOD、GSH-PX等抗氧化酶表達,而Keap1是Nrf2重要調節因子,可與Nrf2結合藕聯呈復合物抑制Nrf2活性[17-18]。Bitar等[19]研究報道,氧化應激是慢性糖尿病并發癥的主要因素,與Nrf2缺失導致的氧化應激積累密切相關。Hayashi等[20]研究報道,Nrf2通過加速細胞遷移參與角膜上皮創傷愈合過程,可能是治療諸如干眼或慢性角膜上皮缺損等角膜上皮疾病的良好靶點。Rabbani等[21]研究報道,抑制Keap1基因表達可加速糖尿病創面愈合。李丹等[22]研究報道,運動可通過激活大鼠心機Keap1/Nrf2信號通路,促進下游SOD、GSH-PX等抗氧化酶表達,提高心肌抗氧化能力,抵抗糖尿病誘導的心肌氧化損傷。本研究結果發現,與NC組比較,DFU組大鼠創面組織中Nrf2蛋白表達量、SOD活性顯著降低,Keap1蛋白表達量、MDA含量升高;與DFU組比較,Sal可增加創面組織Nrf2蛋白表達量及SOD活性,降低Keap1蛋白表達量及MDA含量,提示Sal可能通過調節Nrf2/Keap1信號通路,促進抗氧化酶表達,提高DFU大鼠抗氧化能力,促進創面愈合。

綜上所述,Sal可能通過調節Nrf2/Keap1信號通路,增加DFU大鼠抗氧化能力,促進創面愈合,本研究首次探究Sal促進DFU大鼠創面愈合作用機制,可能對臨床DFU治療提供新的靶點及參考。但關于Sal外敷效果及促進DFU是否涉及其他信號通路共同參與尚不清楚,有待進一步深入探究。