可善挺通過抑制C5a/C5aR1通路對銀屑病小鼠皮膚炎癥和自噬的調控作用

楊 羽趙菊花黎官印李 達王 潔陳 穎李 燃

(川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院,四川 南充 637000)

銀屑病是一種具有強遺傳易感性和自身免疫性致病特征的慢性炎癥性皮膚病[1],對患者的身體健康和生活質量產(chǎn)生顯著影響[1-3]。可善挺(司庫奇尤單抗注射液,Cosentyx)是臨床上治療中度至嚴重斑塊性銀屑病的藥物,通過拮抗IL-17治療銀屑病[4]。最近有研究表明C5a/C5aR1通路在咪喹莫特(IMQ)誘導的小鼠銀屑病皮損中的重要性[5],提示可以通過調節(jié)C5a/C5aR1信號緩解炎癥反應,治療銀屑病。但迄今為止,可善挺是否通過C5a/C5aR1通路治療銀屑病尚無報道,因此本試驗通過咪喹莫特制造銀屑病小鼠模型,探究可善挺通過C5a/C5aR1通路對銀屑病小鼠皮膚炎癥和自噬的調控作用,為臨床上治療銀屑病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

27只雄性8周齡BALB/c小鼠,SPF級,體重(25±2)g,購于成都達碩生物有限公司[SCXK(川)2020-030],實驗在四川大學華西醫(yī)院動物實驗中心進行[SYXK(川)2018-119],本實驗嚴格按照3R原則進行,并通過了四川大學華西醫(yī)院實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審批(IACUC 2020310A)。

1.2 主要試劑與儀器

可善挺?(1 mL:150 mg,司庫奇尤單抗注射液,Cosentyx,瑞士諾華公司);咪喹莫特(IMQ)乳膏(181201,四川明欣藥業(yè)有限責任公司);兔抗LC3(ab48394)、兔抗Beclin(ab62557)、C1qB兔抗(ab92508)、C3兔抗(ab200999)、C5a兔抗(ab202039)、C5aR1兔抗(ab252435)均購自英國Abcam公司;酶標儀(美國,賽默飛);ECL凝膠成像系統(tǒng)(美國,BIO-RAD公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后,將小鼠隨機分為3組,每組9只:分別為空白對照組(Blank group)、銀屑病模型組(Psoriasis-model group)、可善挺治療組(Cosentyx-treat group),分組具體處理如下:

空白對照組(Blank group):僅做備皮處理,使小鼠背部暴露出約4 cm×4 cm矩形無毛區(qū)域。如備皮過程中不慎劃傷小鼠皮膚,則立即使用百多邦軟膏外涂于患處避免感染并將受傷小鼠單籠飼養(yǎng)直至傷口痊愈。

銀屑病模型組(Psoriasis-model group):備皮,使小鼠背部暴露出約4 cm×4 cm矩形無毛區(qū)域,用0.06~0.07 g咪喹莫特乳膏均勻涂抹于小鼠背部無毛區(qū)域,厚度約為1~2 mm,充分涂抹以使藥物被皮膚吸收,早晚各一次,涂抹7 d。7 d后小鼠皮膚造模區(qū)域出現(xiàn)鱗屑、紅斑以及脫屑情況,表明造模成功。同時從造模開始的第1、6、13天在銀屑病造模部位附近進行皮下注射生理鹽水,1 d兩次(早晚各一次),每次30 μL/kg,兩次則60 μL/kg,避免在銀屑病皮損部位進行注射。

可善挺治療組(Cosentyx-treat group):治療組造模方式與模型組相同,然后分別從造模開始的第1、6、13天在銀屑病造模部位附近進行皮下注射可善挺?(司庫奇尤單抗注射液),1 d兩次(早晚各一次),每次30 μL/kg,兩次則60 μL/kg,避免在銀屑病皮損部位進行注射。

分別在造模第2、7、14天均采用脫頸椎法處死,每次3只,用無菌手術剪剪取小鼠背部靶皮損皮膚,并將該皮膚組織平均分為若干份保存于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HE染色

將小鼠皮損組織用4%中性甲醛溶液固定,濃度梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,成片,蘇木精與伊紅染色,在顯微鏡下觀察第14天各組小鼠局部皮損組織的病理學改變拍照并保存。

1.3.3 ELISA檢測

將皮損組織勻漿加入ELISA板中,室溫孵育,洗板5次后加入酶聯(lián)親和物,室溫孵育,洗板,加入底物溶液,室溫下避光孵育,最后加入終止液終止反應。測定450 nm處吸光度(A)值。用IL-4、IL-8、TNF-α和IL-1β的標準品分別制備梯度濃度的工作液,測定標準曲線,計算第2、7、14天局部皮損組織中促炎因子IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β的分泌情況。

1.3.4 髓過氧化物酶(MPO)活性檢測

按照MPO檢測試劑盒說明書(中國,南京建成生物有限公司)將皮損組織與試劑二混合成5%勻漿,加入試劑三,37℃水浴15 min,分裝成兩管,均加入試劑四,然后其中一管加顯色劑,另一管加雙蒸水作為對照,37℃水浴30 min,加入試劑七,60℃水浴10 min,水浴后立即在460 nm處測其吸光度值。然后對第2、7、14天各組小鼠局部皮損組織中性粒細胞(MPO)的浸潤情況進行計算,計算活性值公式如下:

1.3.5 Western blot檢測

通過皮損組織組織蛋白提取、BCA法蛋白濃度確定、SAS-PAGE凝膠電泳、轉模、蛋白免疫印跡、顯色反應等步驟,顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像,Image-Pro Plus分析光密度,以β-actin為內參,空白對照組目標蛋白質相對含量為1,計算各組蛋白質的相對表達量,以此檢測第2、7、14天各組小鼠自噬相關基因Beclin 1和自噬體的經(jīng)典標記物微管相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白在各組小鼠局部皮損組織中的表達量。

1.3.6 免疫組化法檢測

將小鼠皮損組織切片后,選用3% H2O2阻斷5 min,PBS洗滌,選擇加入對應的緩沖液,孵化10 min,洗滌,滴入5% BSA封閉液,室溫孵化30 min,滴入抗體進行孵育,洗滌,生物素標記,二抗孵育,洗滌,BAD顯色,蘇木素復染,在顯微鏡下觀察C5a、C3、C5aR1、C1qB的表達情況,并利用圖像分析利用成像自動分析系統(tǒng)Image-ProPlus進行光密度掃描處理,求出各個標本的積分光密度(IOD)與面積;平均光密度(AOD)即為積分光密度與面積的比值,代表各組標本中細胞化學反應強度的變化。免疫組織化學染色圖片顯示棕黃色為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 19.0分析軟件進行數(shù)據(jù)處理分析,數(shù)據(jù)結果均以平均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示,采用單因素方差分析進行組間比較,分析方法為Duncan多重比較方法,P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 可善挺減緩銀屑病模型小鼠皮膚損傷程度

HE染色結果見圖1,空白對照組皮膚組織表皮結構完整清晰,角化層明顯,復層扁平上皮層較薄,細胞排列較為整齊緊密;真皮內膠原纖維交錯排列,胞質紅染、均勻;結締組織與脂肪層結構清晰可見;皮下肌層肌纖維排列整齊,體積大小均一,細胞核形態(tài)正常,核仁多分布四周;未見明顯病理變化。而通過咪喹莫特造模后,可見復層扁平上皮層增厚,細胞排列紊亂,表皮外層覆蓋一層痂皮;真皮淺層部分膠原纖維壞死,壞死區(qū)域內可見少量的單個圓形深染的淋巴細胞浸潤,較多長橢圓形的成纖維細胞和長梭形的纖維細胞增生,真皮內出血,可見較多紅細胞滲出于纖維組織之間。經(jīng)可善挺治療后,皮膚復層扁平上皮層增厚、細胞排列紊亂、真皮淺層部分膠原纖維壞死、真皮淺層部分內淋巴細胞浸潤和真皮內出血情況等均有所改善,表明可善挺能明顯抑制咪喹莫特誘導的銀屑病引起的小鼠局部皮膚損傷。

圖1 小鼠皮膚HE染色結果Figure 1 HE staining results of mouse skin

2.2 可善挺減輕銀屑病模型小鼠皮膚炎癥反應

通過對小鼠皮損組織中IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO的分泌量檢測(見圖2)發(fā)現(xiàn),銀屑病模型組小鼠皮損組織中IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO分泌量在第2、7、14天均顯著高于空白對照組(P<0.05),表明咪喹莫特誘導了小鼠局部皮損組織的炎癥。經(jīng)可善挺治療后,第2天,與造模組相比,IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO分泌量均下降(P>0.05),治療第7天,可善挺治療組IL-4分泌量顯著低于造模組(P<0.05),IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO也低于造模組(P>0.05),治療第14天,可善挺治療組IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO分泌量均顯著低于造模組(P<0.05),這些結果提示可善挺可以降低皮損組織中促炎因子IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β的分泌和減輕中性粒細胞(MPO)的浸潤情況,從而減輕咪喹莫特誘導的銀屑病模型小鼠皮膚炎癥反應。

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖2 皮損組織中IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β和MPO的檢測結果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 2 Results of IL-4,IL-8,TNF-α,IL-1β,and MPO in lesion tissue

2.3 可善挺增強銀屑病模型小鼠皮膚組織自噬活性

Beclin 1和LC3-Ⅱ/LC3-I檢測結果如圖3所示,銀屑病模型組小鼠Beclin 1相對蛋白表達量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值在第2、7、14天均顯著低于空白對照組(P<0.05),提示咪喹莫特誘導的銀屑病降低了細胞自噬活性。可善挺治療第2天,治療組Beclin 1相對蛋白表達量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值均高于模型組,但差異不顯著(P>0.05),治療第7天和治療第14天,治療組Beclin 1相對蛋白表達量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值顯著高于模型組(P<0.05),本實驗結果表明可善挺能增強銀屑病模型小鼠皮膚組織自噬活性。

2.4 可善挺對銀屑病模型小鼠C5a/C5aR1通路的影響

2.4.1 可善挺對銀屑病模型小鼠C1qB分子表達的影響

免疫組化法檢測小鼠皮損組織C1qB分子表達結果圖4所示,結果表明,實驗的第2天,第7天和第14天咪喹莫特誘導的銀屑病模型組小鼠皮損組織C1qB分子均被廣泛活化。在實驗的第7天和第14天,與銀屑病模型組相比,可善挺治療組小鼠皮損組織中C1qB分子活化被抑制,其中第7天C1qB分子表達顯著降低(P<0.05)。

2.4.2 可善挺對銀屑病模型小鼠C3分子表達的影響

免疫組化法檢測小鼠皮損組織C3分子表達結果如圖5所示,結果表明,實驗的第2天,第7天和第14天咪喹莫特誘導的銀屑病模型組小鼠皮損組織C3分子均被廣泛活化。在實驗的第2天和第7天,與銀屑病模型組相比,可善挺治療組小鼠皮損組織C3分子活化被明顯抑制(P<0.05),表明可善挺抑制了C3分子的表達。

2.4.3 可善挺對銀屑病模型小鼠C5a分子表達的影響

免疫組化法檢測小鼠皮損組織C5a分子表達結果如圖6所示,結果表明,實驗的第2天,第7天和第14天咪喹莫特誘導的銀屑病模型組小鼠皮損組織C5aR1分子均被廣泛活化。在實驗的第2天、第7天和第14天,與銀屑病模型組相比,可善挺治療組小鼠皮損組織C5aR1分子活化被抑制,第7天和第14天C5a分子的表達被顯著抑制(P<0.05)。

2.4.4 可善挺對銀屑病模型小鼠C5aR1分子表達的影響

免疫組化法檢測小鼠皮損組織C5aR1分子表達結果如圖7所示,結果表明,實驗的第2天,第7天和第14天咪喹莫特誘導的銀屑病模型組小鼠皮損組織C5aR1分子均被廣泛活化。在實驗的第2天和第7天,與銀屑病模型組相比,可善挺治療組小鼠皮損組織C5aR1分子活化被明顯抑制(P<0.05),結果與C3分子檢測結果一致。

3 討論

咪喹莫特(IMQ)是銀屑病模型常用的誘導劑,符合銀屑病模型的多項標準[6-8],并且IMQ造模簡單,成本低,因此本實驗采用IMQ誘導的小鼠銀屑病模型[9]。本實驗HE染色結果顯示,IMQ誘導的銀屑病模型組小鼠局部損傷皮膚出現(xiàn)了復層扁平上皮層增厚,細胞排列紊亂,淋巴細胞浸潤,纖維細胞增生等銀屑病組織典型病變,表明IMQ誘導的銀屑病樣小鼠模型建立成功。可善挺治療組HE染色結果表明,可善挺一定程度上抑制了小鼠皮膚組織復層扁平上皮層增厚,淋巴細胞浸潤,纖維細胞增生等現(xiàn)象,提示可善挺減緩了銀屑病模型小鼠皮膚損傷程度,MPO檢測結果也表明,可善挺降低了銀屑病皮損組織中炎性細胞浸潤。

注:A:Western blot結果條帶。(1):空白對照組;(2):銀屑病模型組;(3):可善挺治療組;B:Western blot統(tǒng)計結果。組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖3 Western blot檢測皮膚組織中Beclin 1蛋白相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達量比值Note.A,Results of Western blot band.(1),Blank group.(2),Psoriasis-model group.(3),Cosentyx-treatment group.B,Statistics of Western blot.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 3 Results of Beclin 1 and LC3-Ⅱ/LC3-I in lesion tissue

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖4 皮損組織C1qB免疫組化檢測結果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 4 Immunohistochemical result of C1qB in skin lesions

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖5 皮損組織C3免疫組化檢測結果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 5 Immunohistochemical result of C3 in skin lesions

補體系統(tǒng)作為抵御外來病原體的第一道防線,是先天免疫最重要的分支之一[5]。補體通過經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑匯集到C3分子水平發(fā)揮作用[10]。C1qB是補體經(jīng)典途徑重要分子,通路激活后,補體C3分子活化,然后C3分子通過活化下游C5a/C5aR1通路進而參與疾病的發(fā)生[11],此外,補體活化過程產(chǎn)物C3a(C3裂解產(chǎn)物)和C5a也會參與炎癥反應[12]。有研究表明補體系統(tǒng)參與了銀屑病炎癥過程,C5a/C5aR1通路可以調節(jié)銀屑病小鼠皮損組織中TNF-α,IFN-α/γ,IL-17A,IL-22,IL-23A等促炎因子的表達[5]。而銀屑病是一種以Th1、Th2和Th17炎癥軸失衡為特征的疾病[13],可善挺是IL-17A拮抗劑[14],研究表明可善挺可以通過拮抗IL-17治療銀屑病[4],但尚無人研究可善挺是否通過C5a/C5aR1信號通路調節(jié)銀屑病炎癥。因此,本研究準備補上這個空白,我們實驗證明可善挺可能通過抑制C5a/C5aR1通路,降低IL-4、IL-8、TNF-α、IL-1β炎癥因子的表達,提示靶向抑制C5a/C5aR1信號通路可能是一種新的治療銀屑病的方法。

自噬是細胞受到應激時消除受損或有害成分,從而使細胞存活的細胞過程[15-17]。Beclin1(也稱為Atg6)是自噬初始階段雙膜自噬體形成所必需的因子[18],主要通過與其他自噬相關蛋白如Bcl-2、Vps34等結合形成巨大的蛋白復合物來促進自噬的啟動[19]。LC3與自噬空泡的數(shù)量成正比,LC3-I向LC3-Ⅱ轉化被認為是自噬活化的標志[20-22]。補體系統(tǒng)與細胞自噬也具有相關性,自噬過程中,C3可以通過C3/ATG16L1通路激活細胞自噬[23]。有研究表明,在糖尿病條件下,C3蛋白維持自噬,防止β細胞死亡[23]。在生理條件下,補體蛋白C3沉積在細菌上,通過直接的C3/ATG16L1相互作用使細菌被靶向自噬,導致自噬依賴的細菌生長受限[24]。在本研究中可善挺抑制了C5a/C5aR1信號通路,但卻提高了銀屑病皮損組織中的自噬活性,表明C3在銀屑病模型中可能不是參與調控銀屑病細胞自噬的主要途徑,可善挺可能通過其它通路對細胞自噬進行調節(jié)。因此,針對可善挺活化銀屑病皮損組織細胞自噬的分子機制有待進一步研究。

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖6 皮損組織C5a免疫組化檢測結果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 6 Immunohistochemical result of C5a in skin lesions

注:組間比較,有字母相同,P>0.05;無字母相同,P<0.05。圖7 皮損組織C5aR1免疫組化檢測結果Note.Comparison between groups,there are letters the same,P>0.05.No letters the same,P<0.05.Figure 7 Immunohistochemical result of C5aR1 in skin lesions

本研究表明,可善挺增強了銀屑病小鼠皮損組織自噬活性,并通過調節(jié)C5a/C5aR1信號通路緩解了IMQ誘導的銀屑病小鼠皮損組織炎癥,為臨床上使用可善挺治療銀屑病提供了理論依據(jù)。同時也表明靶向抑制C5a/C5aR1信號通路是一種可行的治療銀屑病的方法。此外,可善挺是否通過C5a/C5aR1通路調節(jié)銀屑病皮損組織細胞自噬效果還需進一步研究。