小鼠肺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

石桂英黃藝瀅雷雪裴路亞嵐白 琳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

間充質(zhì)干細(xì)胞是一群能夠形成克隆的成纖維樣細(xì)胞。國際細(xì)胞和基因治療學(xué)會(International Society for Cell & Gene Therapy,ISCT)對間充質(zhì)干細(xì)胞的分類標(biāo)準(zhǔn)是:高表達(dá)CD73、CD90和CD105,不表達(dá)血液細(xì)胞標(biāo)記如CD34、CD45、CD11b等[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用,在各組織器官中都有組織特異性的間充質(zhì)干細(xì)胞[2]。肺作為多種動物的呼吸器官,機(jī)體通過肺與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換,各種有害物質(zhì)如化學(xué)氧化劑、蛋白酶、病毒、細(xì)菌等都可造成肺損傷。盡管存在眾多因素會導(dǎo)致肺損傷,但正常個體仍能保持正常的肺功能,這說明肺部具有強(qiáng)大的損傷修復(fù)和再生能力[3]。肺間充質(zhì)干細(xì)胞(lung-resident mesenchymal stem cell,lr-MSC)首先是在肺灌洗液中發(fā)現(xiàn)的,2014年Rolandsson等[4]在支氣管壁和肺實(shí)質(zhì)的血管周組織中分離出lr-MSC,證實(shí)了lr-MSC的位置和表型等特征。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比,lr-MSC表達(dá)相似的表面蛋白,在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和分泌組學(xué)等方面均有所不同[5-6],其在肺生理和病理過程中的作用,以及在治療肺部疾病中的應(yīng)用前景,還有待深入研究[2]。

本項(xiàng)目從C57BL/6J小鼠中利用兩種方法分離培養(yǎng)了lr-MSC,對其的形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)記物及多向分化能力進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)lr-MSC為成纖維樣細(xì)胞,表達(dá)Sca-1、CD90、CD29、CD44等干細(xì)胞表面標(biāo)記,不表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)記CD31和白細(xì)胞表面標(biāo)記CD45,具有成脂、成骨分化能力。lr-MSC的分離、培養(yǎng)和鑒定可以為研究lr-MSC的功能提供體外模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57小鼠6只,體重18~22 g,4周齡,雌雄各半,購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2020-0004],實(shí)驗(yàn)操作在研究所解剖室進(jìn)行[SYXK(京)2019-0014],實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會審批(BL17002),實(shí)驗(yàn)中按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清(批號:1908360C)、α-MEM(批號:2120408)、DPBS(批號:2120391)、青鏈霉素(批號:2076677)、胰酶(批號:2062475)、流式抗體等均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;組織消化用Ⅰ型膠原酶(批號:9001-12-1)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;成骨(批號:191002G001、成脂(批號:191107G001)誘導(dǎo)培養(yǎng)液均購自賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司;流式細(xì)胞儀為AriaⅡ,購自美國Becton Dickinson公司;CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

脫頸椎處死小鼠,75%乙醇浸泡消毒后,置于超凈臺上,無菌條件下分離肺組織,用PBS沖洗干凈,剪成1 mm3小組織塊,一半加入α-MEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素)直接接種6孔板,37℃,5% CO2培養(yǎng),每3 d換液,細(xì)胞從組織塊爬出融合達(dá)80%左右時,胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代,同時去除組織塊;另一半加入等體積0.1%膠原酶Ⅰ,37℃振蕩消化2 h,加入等體積PBS后離心,1500 r/min,5 min,棄上清,加入2 mL α-MEM完全培養(yǎng)基,經(jīng)70 μm細(xì)胞篩過濾,計(jì)數(shù),接種到6孔板,106細(xì)胞/孔,37℃,5% CO2培養(yǎng)。24 h后換液,此后每3 d換液,細(xì)胞融合達(dá)80%左右時,進(jìn)行傳代。

1.3.2 生長曲線測定

取第3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,接種24孔板,104個/孔。自接種后第2天起,每隔48 h取3孔消化計(jì)數(shù),記錄細(xì)胞數(shù),繪制生長曲線。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測干細(xì)胞比例

取第3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,胰酶消化收集細(xì)胞,計(jì)數(shù),離心,1500 r/min,5 min,棄上清,加入適量PBS,調(diào)整細(xì)胞濃度為107/mL,取106細(xì)胞加入流式抗體,進(jìn)行染色,4℃,30 min。染色抗體為:CD31-FITC,CD90-FITC,CD29-PE,CD45-PE,Sca-1-PE-cy7,CD44-APC-cy7。

1.3.4 誘導(dǎo)成脂

取第3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,接種24孔板,104個/孔,37℃,5% CO2培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%以上時,吸棄培養(yǎng)基,加入2 mL成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基,之后每3 d換液,誘導(dǎo)21 d左右,觀察細(xì)胞變化,對照組加α-MEM完全培養(yǎng)基。成脂鑒定采用油紅O染色:吸棄誘導(dǎo)培養(yǎng)基,加PBS洗2次;加4%多聚甲醛固定30 min;吸棄多聚甲醛固定液,加入60%異丙醇洗2次;加入油紅O染色液,染色60 min;吸棄染色液,加PBS洗3次,倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.3.5 誘導(dǎo)成骨

取第3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,接種24孔板,104個/孔,37℃,5% CO2培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)60%~80%時,吸棄培養(yǎng)基,加入2 mL成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,之后每3 d換液,誘導(dǎo)21 d左右。成骨鑒定采用茜素紅染色:吸棄誘導(dǎo)培養(yǎng)基,加PBS洗2次;加4%多聚甲醛固定30 min;吸棄多聚甲醛固定液,加茜素紅染色液,染色5 min;吸棄染色液,加PBS洗3次,倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 6軟件,結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,組間比較用t檢驗(yàn),P<0.05,認(rèn)為差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生長特性

本實(shí)驗(yàn)采用膠原酶消化和肺組織塊直接培養(yǎng)兩種方法分離lr-MSC。膠原酶消化法,在接種后第2天即可見細(xì)胞貼壁,之后迅速擴(kuò)增;而組織塊培養(yǎng)法,細(xì)胞貼壁較慢,第4天時可見細(xì)胞貼壁(圖1)。兩種方法分離的細(xì)胞傳代至第三代時,細(xì)胞均為成纖維樣形態(tài),傳代時間基本一致(圖2)。

注:上行為肺組織經(jīng)膠原酶Ⅰ消化后細(xì)胞貼壁生長狀態(tài),從左到右依次為培養(yǎng)2、5、8 d的細(xì)胞;下行為肺組織直接培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁生長狀態(tài),從左到右依次為培養(yǎng)2、5、8 d的細(xì)胞。圖1 原代肺間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁生長狀態(tài)Note.Upper line shows the status of cell adherent growth after collagenaseⅠdigestion,from left to right,the culture day is 2,5,8 days.Next line shows the status of cell adherent growth with lung tissues,from left to right,the culture day is 2,5,8 days.Figure 1 Lung mesenchymal stromal cells

注:A:細(xì)胞形態(tài);B:生長曲線。圖2 肺間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)和生長曲線Note.A,Cell morphology.B,Growth curve.Figure 2 Morphology and growth curve of lung mesenchymal stromal cells

2.2 干細(xì)胞比例

取第三代細(xì)胞標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物,陰性標(biāo)記物CD45、CD31均為低表達(dá),陽性標(biāo)記物Sca-1、CD90、CD29、CD44的表達(dá)量均在90%以上(圖3)。從細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)來看,所得細(xì)胞符合干細(xì)胞特性。

圖3 肺間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記流式分析Figure 3 FACS results for the surface markers of lung mesenchymal stromal cells

2.3 誘導(dǎo)成脂能力

為檢測lr-MSC的成脂分化能力,取第三代細(xì)胞接種至24孔板,成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21 d后,油紅O染色,可見細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴,但仍有部分細(xì)胞未分化為脂肪細(xì)胞(圖4)。

2.4 誘導(dǎo)成骨能力

為檢測lr-MSC的成骨分化能力,取第三代細(xì)胞接種至24孔板,成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21 d后,茜素紅染色,可見鈣鹽沉積著紅色(圖5)。

3 討論

作為機(jī)體與外環(huán)境進(jìn)行氣體交換的器官,肺組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜,構(gòu)成細(xì)胞較多,包括多種上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞等[7]。Hegab等[8]分離了lr-MSC,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表型為Sca1+CD45-CD31-,體外培養(yǎng)時能夠自我更新,并能分化成內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等,同時還具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性;將lr-MSC移植到肺損傷小鼠模型中,可以提高小鼠的生存率,減少肺損傷。已有研究表明,lr-MSC是肺組織修復(fù)和再生的重要調(diào)節(jié)因子,特發(fā)性肺纖維化是由lr-MSC分化為成肌細(xì)胞所導(dǎo)致的[9-10]。本研究采用膠原酶消化和肺組織塊直接培養(yǎng)兩種方法分離lr-MSC。膠原酶消化法,細(xì)胞貼壁快,可在較短時間內(nèi)獲得大量細(xì)胞;而組織塊培養(yǎng)法,細(xì)胞貼壁較慢,第4天時可見細(xì)胞貼壁。在之后的傳代過程中,兩種方法分離所得細(xì)胞的增殖速度基本一致。本研究兩種方法分離的細(xì)胞表型無差別,與Hegab等[8]分離的細(xì)胞表型一致,表現(xiàn)為Sca1+CD45-CD31-CD90+CD29+CD44+。在分化能力方面,本研究進(jìn)行了成脂和成骨誘導(dǎo)分化,誘導(dǎo)21 d后分別形成了脂滴和鈣鹽沉積,可見所得lr-MSC具有多向分化能力。在誘導(dǎo)21 d后仍有部分細(xì)胞未分化,這可能與誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)效率、誘導(dǎo)時間,以及l(fā)r-MSC細(xì)胞組成等有關(guān),在后續(xù)研究中將調(diào)整誘導(dǎo)液各組分的濃度、延長誘導(dǎo)時間以提高誘導(dǎo)效率,同時分析lr-MSC多種表面標(biāo)記,以深入了解lr-MSC的細(xì)胞組成情況。

注:A:對照組;B:誘導(dǎo)組。圖4 肺間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化Note.A,Control group.B,Induced group.Figure 4 Adipogenic differentiation of lung mesenchymal stromal cells

注:A:對照組;B:誘導(dǎo)組。圖5 肺間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化Note.A,Control group.B,Induced group.Figure 5 Osteogenic differentiation of lung mesenchymal stromal cells

本研究成功分離獲得了lr-MSC,建立了穩(wěn)定的lr-MSC分離、培養(yǎng)和鑒定技術(shù)體系,這將為后續(xù)深入研究提供基礎(chǔ)。