王洪建，劉燕飛，李智全，紀國超，武欣，李志春

濮陽市人民醫院檢驗科，河南 濮陽 457000

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）作為血液系統常見惡性腫瘤之一，多于中老年人群高發，疾病早期缺乏特異性表現，隨著中國老齡化人口增多，醫療水平的提升，其在中國發病率呈上升趨勢。MM 通過單克隆漿細胞增殖間分泌出的大量單克隆免疫球蛋白，抑制正常多克隆漿細胞和免疫球蛋白分泌，由于單克隆漿細胞具有無限增生、廣泛浸潤的特性，導致機體出現各種不良反應。MM 主要臨床特征為出現骨髓瘤細胞，且各患者細胞數不盡相同，其細胞數高低不僅與血清單克隆免疫球蛋白的水平、骨質破壞程度、尿中輕鏈含量、血清鈣值等有關，同時還與疾病的不良反應、患者預后密切相關。近年來，隨著多色流式技術的不斷發展，多參數流式細胞術在MM 診斷中的應用日益廣泛，該技術可通過不同抗體間混合，快速測量單個相關生物學特點，從而對MM 進行量化評估，但對其預后研究相對較少。基于此，本研究對MM 患者使用多參數流式細胞術檢測，分析其預后預測價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年10月至2017年10月于濮陽市人民醫院治療的MM 患者病歷資料。納入標準：①符合《血液病診斷及療效標準（第三版）》中MM的診斷標準；②初診患者，實施多參數流式細胞術檢查，疾病確診時間在檢查結束后2周內；③多參數流式細胞術檢查前未實施有創檢查，且未實施任何放化療方案治療；④具有完整的臨床資料、病理資料及隨訪資料，能正常獲取研究所需全部信息；⑤經多參數流式細胞術檢查后至少接受過1次化療。排除標準：①心肺基礎功能相對較差，無法耐受化療，未完成1個完整的化療周期；②出現髓外病變；③未接受治療或拒絕接受治療；④合并其他嚴重疾病，如重要臟器（心、肺、肝、腎等）功能不全、惡性腫瘤、腦梗死等。根據納入、排除標準，共納入86例MM患者作為觀察組，其中男46 例，女40 例；年齡50～75 歲，平均（62.38±7.12）歲；M蛋白類型：免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G型40例（46.51%），IgA型22例（25.58%），IgD型8 例（9.30%），輕鏈型16 例（18.60%）；診斷時臨床分期：Ⅰ期7 例（8.14%），Ⅱ期16 例（18.60%），Ⅲ期63例（73.26%）；治療方案：13例（15.12%）使用馬法蘭+強的松（MP）方案，1～3 個療程；25 例（29.07%）使用環磷酰胺+長春新堿+卡氮芥+馬法蘭+強的松（M2）方案，1～4 個療程；48 例（55.81%）使用長春新堿+多柔比星+地塞米松±沙利度胺（VAD±T）方案，1～3 個療程。另選取同期健康體檢過程中自愿接受多參數流式細胞術檢查的健康體檢者40例作為對照組，其中男25 例，女15 例；年齡50～75 歲，平均（63.76±7.55）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（

P

﹥0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

兩組患者均使用Navios三激光十色流式細胞儀（購自Beckman-Coluter公司）進行免疫表型檢查，其中鼠抗人單克隆抗體分別為CD45、CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，檢查方式：無菌下抽取受試人群2 ml骨髓液，加入肝素抗凝，再將200 μl骨髓單細胞懸液加入2 ml 氯化銨溶血15 min，生理鹽水洗兩遍。取干粉多色抗體管，加入溶血標本處理液，混勻避光15 min，生理鹽水洗一次，再加固定液100 μl，混勻避光15 min，洗一次后加穿孔劑100 μl，充分吹打細胞混勻，加入cKappa/cLamda 液1 μl，混勻避光30 min，完成后上機檢測。cKappa與cLamda結果判定：cKappa 與cLamda 雙陽為正常多克隆漿細胞；cKappa與cLamda單陽為異常克隆性細胞；如果cKappa 與cLamda 中一個陽性而另一個弱陽性且兩者比例大于3∶1也判定為異常克隆漿細胞。

觀察組患者入院后進行常規對癥支持治療，再進行流式細胞儀檢查，待患者生命體征平穩后實施化療，實施為期2 年隨訪（截至2019 年10 月），主要隨訪形式有門診隨訪、家訪、電話隨訪等，并填寫相關隨訪記錄。

1.3 觀察指標

觀察兩組受試人群多參數流式細胞術的免疫表型（CD19、CD117、CD56、CD138、CD38）克隆漿細胞表達情況。收集觀察組患者2 年隨訪資料，觀察其總生存率，即初始治療時間至死亡或末次隨訪截止日期，對比不同免疫表型陽性和陰性患者的總生存率。參照相關文獻[6-7]，以CD45/SS 設門，分別為CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）、CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD56（+）、CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD117（+），每組均確定cKappa/cLamda 抗體組合為異常單克隆后進行結果分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 漿細胞免疫表型陽性率的比較

兩組受試者CD138 陽性率比較，差異無統計學意義（

P

﹥0.05）；觀察組患者CD19 陽性率明顯低于對照組，CD117、CD56、CD38 陽性率均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01）。（表1）

表1 兩組受試者漿細胞免疫表型陽性情況的比較[n（%）]

2.2 總體生存情況

觀察組86 例MM 患者1、2 年總生存率分別為83.72%（72/86）、69.77%（60/86）。

2.3 漿細胞不同免疫表型陽性和陰性MM 患者2年總生存率的比較

Kaplan-Meier 法生存分析結果顯示：CD19、CD117、CD138、CD38 免疫表型陽性和陰性MM 患者的2 年總生存率比較，差異均無統計學意義（

P

﹥0.05）；CD56 免疫表型陽性MM 患者的2 年總生存率明顯高于陰性MM 患者，差異有統計學意義（

P

﹤0.01）。（表2）

表2 不同免疫表型陽性和陰性MM 患者2 年總生存情況的比較（n=86）

2.4 不同免疫表型預測MM 預后的ROC 曲線分析

ROC 曲 線 分 析 結 果 顯 示，CD19、CD117、CD138、CD38 免疫表型對MM 患者的預后預測價值有限（AUC﹤0.6），CD56 免疫表型對MM 患者有一定的預后預測價值（AUC﹥0.6）。（表3、圖1）

圖1 不同免疫表型預測MM預后的ROC曲線

表3 不同免疫表型對MM 的預后預測價值

2.5 不同組合預測MM 預后的ROC 曲線分析

CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）對MM 患者預后 預 測 價 值 明 顯 高 于CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，差異均有統計學意義（

Z

=5.212、2.802、3.038、3.223、3.303，

P

﹤0.01）；CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD56（+）對MM 患者預后預測價值高于CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，差異均有統計學意義（

Z

=4.670、2.019、2.205、2.492、2.553，

P

﹤0.05）；CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD117（+）對MM 患者預后預測價值高于CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，差異均有統計學意義（

Z

=4.374、2.045、2.511、2.864、2.934，

P

﹤0.05）。ROC 曲線分析結果顯示，不同組合對MM 患者預后預測價值均高于免疫表型預后預測價值（

P

﹤0.05），且CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）的AUC 最大，提示其預后預測價值最高。（表4、圖2）

圖2 不同組合預測MM預后的ROC曲線

表4 不同組合對MM 的預后預測價值

3 討論

MM 是以骨髓中漿細胞異常增殖為特點的惡性腫瘤，疾病早期無特異性表現，發病機制尚不明確，主要為骨髓瘤骨病，導致患者臨床表現各異，臨床漏診、誤診率均較高。現階段國內對MM診斷多采用骨髓穿刺漿細胞比例檢測和影像學指標相結合，但骨髓瘤細胞形態與正常細胞類似，導致傳統形態學診斷效果欠佳，少數疑似病例無法進行準確診斷。流式細胞技術是近年興起的一項免疫學技術，該技術能有效彌補傳統診斷方式的不足，在不破壞細胞、細胞器、微粒結構及抗原功能情況下，通過流式細胞儀對單細胞進行高速、準確、多參數定量分析。流式細胞技術作為現代骨髓瘤診斷的先進技術，通過其表面特異性抗原表達，能有效鑒別惡性腫瘤細胞，同時也被用于對大多數惡性血液疾病療效的監測。

MM 作為現階段無法治愈的疾病之一，主要治療目的為延長患者生存期，一旦確診后需長期多次來院檢查、復查及治療，且疾病具有高度異質性，預后差異明顯。因此，對患者進行準確的預后判斷，再采取對應的治療方案，是現代骨髓瘤治療研究的熱點方向之一。流式細胞術作為MM檢測的高敏技術，能利用腫瘤細胞表面特征性異常表型，將腫瘤細胞與正常細胞進行區分，再通過識別免疫表型的異常表達對MM 進行鑒別診斷。本研究使用流式細胞技術對MM 患者進行鑒別診斷，發現觀察組患者CD138 陽性率與對照組比較，差異無統計學意義（

P

﹥0.05），而觀察組患者CD19陽性率明顯低于對照組，CD117、CD56、CD38 陽性率均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01），這與林飛燕等研究結果基本一致。本研究發現MM 患者1、2 年生存率分別為83.72%、69.77%，其中CD19、CD117、CD138、CD38免疫表型陽性和陰性MM 患者2 年總生存率比較，差異均無統計學意義（

P

﹥0.05）；CD56 免疫表型陽性MM 患者2 年總生存率高于陰性MM 患者，差異有統計學意義（

P

﹤0.05），這與滑歡和張學軍研究結果基本一致，可能是因為CD56 作為免疫球蛋白超家族重要成員之一，對腫瘤細胞歸巢起到一定介導作用，導致其在疾病治療期間呈波動狀態。本研究還將其結果進行ROC 曲線分析，發現不同免疫表型對疾病預后預測價值有限，而CD56免疫表型對MM 患者預后有一定預測價值，這可能是因為免疫表型能有效鑒別漿細胞良性和惡性，但單項免疫表型檢測會遺漏部分腫瘤細胞群，進而對預測結果造成一定影響。

流式細胞術在惡性漿細胞診斷中的靈敏度遠超傳統形態學技術，因為傳統形態學無法確定其克隆性，容易造成誤診、誤治。近年來對MM 免疫表型分析發現，骨髓瘤特異性抗原表達能在一定程度上預測疾病預后，且已闡明多項骨髓瘤特異性抗原表達，明確多種免疫表型臨床意義，但尚未統一其設門方案。為此，本研究還將多種免疫表型進行組合，分析不同組合對MM 的預后預測價值，經ROC 曲線分析發現，不同組合對MM 患者預后預測價值均高于免疫表型，說明在臨床研究過程中可通過聯合診斷提高靈敏度和特異度，進一步提高預后預測價值，同時本研究還發現CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）聯合診斷的曲線下面積最大，提示其預后預測價值最高。

綜上所述，MM 患者與健康人群細胞免疫表型存在明顯差異，且使用多參數流式細胞術對MM的診斷有一定價值，可通過不同免疫表型間組合提高其診斷的準確性。隨著各種新的單克隆抗體出現，流式細胞術對MM 的診斷會越來越準確和完善。