王明輝，李永杰，李道宏，牟婧祎

1開封市婦產醫院婦科，河南 開封 475000

2河南省人民醫院婦產科，鄭州 450003

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤，發病率和病死率均較高，嚴重影響患者的生活質量。研究顯示，基因表達異常與腫瘤發生發展密切相關，這些異常表達的基因可參與調控腫瘤細胞的惡性增殖過程，這也是腫瘤靶基因治療研究領域的重點。生長抑制因子4（inhibitor of growth family member 4，ING4）是腫瘤生長抑制因子家族成員，有核定位信號，可參與調控細胞生長。

ING4

在多種腫瘤中發揮抑癌基因的作用，具有抵抗細胞生長和誘導凋亡的作用，其在卵巢癌、乳腺癌、膠質瘤等腫瘤中表達下調。ING4 的作用機制較為復雜，能通過調控多種信號轉導通路發揮生物學功能。既往研究顯示，ING4 通過影響WNT 信號通路參與調控肺腺癌細胞的生長。目前，臨床對ING4 在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞生物學行為的調控機制尚不清楚。本研究首先初步探討ING4 在宮頸癌組織和細胞中的表達差異，通過慢病毒轉染上調

ING4

的表達，探討ING4 對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響和調控機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年7 月至2018 年12 月開封市婦產醫院收治的宮頸癌患者。納入標準：①經病理學檢查確診為原發性宮頸癌；②術前均未行放化療和免疫治療等相關治療；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并精神疾病或精神疾病家族史；③合并智力或認知功能障礙。依據納入和排除標準，本研究共納入50 例宮頸癌患者，年齡28～78 歲，中位年齡59 歲；臨床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期11 例。取50 例宮頸癌患者的宮頸癌組織及相應癌旁組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞、主要試劑和儀器 宮頸癌細胞系Hela、SiHa 均購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫，宮頸癌細胞系CaSki 購自無錫欣潤生物科技有限公司，正常宮頸細胞系Ect1/E6E7 購自北京北納創聯生物技術研究院。caspase 3 抗體、β-catenin 抗體均購自碧云天生物技術有限公司，互補DNA（complementary DNA，cDNA）合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，ING4 抗體、c-myc 抗體均購自美國Abcam 公司，膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡測定試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，陰性對照慢病毒和

ING4

過表達慢病毒由湖南豐暉生物科技有限公司構建。1.2.2 定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測宮頸癌組織和細胞中

ING4

的相對表達量 分別取宮頸癌組織、癌旁組織、宮頸癌細胞 系Hela、SiHa、CaSki 和 正 常 宮 頸 細 胞 系Ect1/E6E7，采用Trizol 法提取組織和細胞中的RNA，紫外分光光度計測定RNA 的光密度（optical density，OD），OD/OD比值為1.8～2.0。采用cDNA 合成試劑盒反轉錄合成cDNA，取適量的cDNA，以SYBR Green qRT-PCR 進行定量PCR。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃反應15 s，55 ℃孵育30 s，72 ℃孵育30 s。以

β

-

actin

作為內參，采用2法計算

ING4

mRNA的相對表達量。

β

-

actin

上游引物：5'-CGAAACTACCTTCAACTCCATCA-3'，下 游 引 物：5'-CGGACTCGTCATACTCCTGCT-3'；

ING4

上游引物：5'-GGACCTGAAGGCTGAAATTGAC-3'，下游引物：5'-GTCACTGAGGGCATCCCATAC-3'。

1.2.3 蛋白質印跡（Western blot）法檢測宮頸癌細胞中ING4 蛋白的相對表達量 利用放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白提取試劑提取宮頸癌細胞系Hela、SiHa、CaSki 和正常宮頸細胞系Ect1/E6E7 中的總蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠采用10%的分離膠及4%的濃縮膠，常規方法配制。將提取的蛋白樣品進行變性（與loading buffer 混合煮沸5 min）處理，上樣孔內蛋白樣品量為40 μg，設置濃縮膠中電壓為80 V，分離膠中電壓為120 V。肉眼觀察染料跑出凝膠底部時停止電泳。按照1 mA/cm進行電轉膜。取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，經過5%牛血清白蛋白室溫封閉后，將PVDF 膜轉移到一抗稀釋液（NG4 一抗以1∶600 稀釋）中，4 ℃孵育過夜，然后將PVDF膜放置于二抗稀釋液[辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記，以1∶3000 稀釋]中，室溫中孵育1 h。電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）法顯色，利用Labworks 4.6掃描灰度值，以β-actin為內參，計算ING4蛋白的相對表達量。

1.2.4 慢病毒轉染和分組方法 取

ING4

mRNA 和ING4 蛋白相對表達量最低的宮頸癌細胞CaSki 進行轉染，將宮頸癌細胞CaSki 接種至24 孔板，以MOI=20 的慢病毒轉染細胞，24 h 后換液，培養72 h后觀察熒光表達情況，結果顯示，轉染效率﹥90%，分別將轉染

ING4

過表達的慢病毒和穩定陰性對照慢病毒的細胞作為Lv-ING4 組和Lv-NC 組，將沒有轉染慢病毒的細胞作為對照組。

1.2.5 CCK8 法檢測細胞增殖能力 取對照組、Lv-NC 組、Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki，接種至96 孔板，接種28 h 后取出細胞培養板，添加100 μl 的CCK8 溶液，然后置于培養箱中繼續培養4 h。采用酶標儀測定450 nm 波長處的OD 值。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡能力 取對照組、Lv-NC 組、Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki，0.25%的胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）將細胞沉淀重懸洗滌2 次，最后將細胞懸浮于500 μl 的結合緩沖液中，然后依次添加Annexin V-FITC 和PI 染液，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7 Western blot 法 檢 測 細 胞caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白的相對表達量 取對照組、Lv-NC 組、Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki，按照1.2.3 中Western blot 法檢測各組細胞caspase 3、β-catenin、cmyc 蛋白的相對表達量，其中caspase 3、β-catenin、c-myc一抗的稀釋倍數分別為1∶400、1∶600、1∶600。1.2.8 WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理對

ING4

過表達的宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響 收集穩定轉染

ING4

過表達的Lv-ING4 組宮頸癌細胞，分別以0、20 mmol/L 的WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理培養，分別作為Lv-ING4 組和Lv-ING4+LiCl 組，培養48 h 后，采用上述CCK8 法檢測細胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞凋亡能力，Western blot 法測檢測各組細胞caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 不同組織和細胞中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對表達量的比較

宮頸癌組織中

ING4

mRNA 的相對表達量為（0.32±0.02），明顯低于癌旁組織的（1.42±0.06），差異有統計學意義（

t

=17.93，

P

﹤0.01）。宮頸癌細胞Hela、CaSki、SiHa 中

ING4

mRNA 和ING4 蛋白的相對表達量均明顯低于正常宮頸細胞Ect1/E6E7，宮頸癌細胞CaSki 中

ING4

mRNA 和ING4 蛋白的相對表達量均明顯低于宮頸癌細胞Hela、SiHa，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01）（表1）。

表1 宮頸癌細胞Hela、CaSki、SiHa 和正常宮頸細胞Ect1/E6E7 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對表達量的比較（±s）

2.2 各組宮頸癌細胞CaSki 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對表達量的比較

取

ING4

mRNA 和ING4 蛋白相對表達量最低的宮頸癌細胞CaSki 進行轉染，慢病毒轉染后，Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki 中

ING4

mRNA 和ING4蛋白相對表達量均明顯高于對照組和Lv-NC 組，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01）；對照組與Lv-NC組宮頸癌細胞CaSki 中

ING4

mRNA 和ING4 蛋白的相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

﹥0.05）。（表2）

表2 各組宮頸癌細胞CaSki 中ING4 mRNA 和ING4 蛋白相對表達量的比較（±s）

2.3 ING4過表達對宮頸癌細胞CaSki增殖和凋亡的影響

慢病毒轉染后，Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki的OD 值明顯低于對照組和Lv-NC 組，細胞凋亡率明顯高于對照組和Lv-NC 組，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01）；對照組與Lv-NC 組宮頸癌細胞CaSki的OD 值和凋亡率比較，差異均無統計學意義（

P

﹥0.05）。（表3、圖1）

表3 ING4過表達對宮頸癌細胞CaSki的OD值和凋亡率的影響（±s）

圖1 流式細胞儀檢測ING4過表達對宮頸癌細胞CaSki凋亡的影響

2.4 ING4過表達對宮頸癌細胞CaSki中caspase 3、β-catenin、c-myc 蛋白相對表達量的影響

慢病毒轉染后，Lv-ING4 組宮頸癌細胞CaSki中caspase 3 蛋白的相對表達量明顯高于對照組和Lv-NC 組，β-catenin、c-myc 蛋白的相對表達量均明顯低于對照組和Lv-NC 組，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01）；對照組與Lv-NC 組宮頸癌細胞CaSki中caspase 3、β-catenin、c-myc 蛋白的相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

﹥0.05）。（表4）

表4 ING4 過表達對宮頸癌細胞CaSki 中caspase 3、βcatenin、c-myc 蛋白相對表達量的影響（±s）

2.5 WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理對ING4過表達的宮頸癌細胞CaSki增殖和凋亡的影響

Lv-ING4+LiCl 組宮頸癌細胞OD 值明顯高于Lv-ING4 組，凋亡率明顯低于Lv-ING4 組，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01）。（表5、圖2）

圖2 流式細胞儀檢測WNT/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理對ING4過表達宮頸癌細胞CaSki凋亡的影響

表5 WNT/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理對ING4過表達宮頸癌細胞CaSki的OD值和凋亡率的影響（±s）

2.6 WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理對ING4 過表達宮頸癌細胞CaSki 中β-catenin、cmyc、caspase 3 蛋白相對表達量的影響

Lv-ING4+LiCl 組宮頸癌細胞caspase 3 蛋白相對表達量低于明顯Lv-ING4 組，β-catenin、c-myc 蛋白相對表達量均明顯高于Lv-ING4 組，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01）。（表6）

表6 WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl 處理對ING4 過表達宮頸癌細胞CaSki 中β-catenin、c-myc、caspase 3蛋白相對表達量的影響（±s）

3 討論

ING4 首先在人體垂體組織中發現，其編碼蛋白質的C 末端具有高度保守性和核定位作用，ING4 具有廣泛的生物學作用，參與腫瘤細胞的生長過程。研究表明，ING4 可抑制多種腫瘤的發生發展過程，腫瘤組織中ING4 表達下調與腫瘤細胞的惡性增殖有關。ING4 在子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤組織中表達下調，具有抑制腫瘤細胞體外惡性生長的作用。本研究結果表明，

ING4

在宮頸癌組織和細胞中表達下調，上調

ING4

的表達后，宮頸癌細胞的增殖能力降低，這可能提示，ING4在宮頸癌進展中發揮類似抑癌基因的作用。腫瘤細胞凋亡率降低是腫瘤細胞惡性生長的基礎，而細胞凋亡是一個復雜的過程，需要細胞內一系列基因通過復雜的調控網絡共同誘導。目前，臨床對細胞凋亡的研究發現，caspase 與細胞凋亡關系密切，caspase 由多個蛋白成員組成，這些蛋白成員被激活后可以形成一個凋亡級聯反應，最終誘導細胞凋亡。caspase 3 在凋亡級聯反應中位于最下游，也是細胞凋亡執行的關鍵蛋白，正常情況下，caspase 沒有活性，只有被激活后形成caspase 3 才可以誘導細胞凋亡的發生，caspase 3 活化也被認為是凋亡不可逆的標志之一。本研究結果顯示，慢病毒轉染上調

ING4

的表達后，宮頸癌細胞中caspase 3 蛋白的相對表達量升高，細胞凋亡率也升高，提示上調

ING4

的表達可以誘導宮頸癌細胞發生凋亡，

ING4

在宮頸癌進展中可能扮演抑癌基因的作用。本實驗進一步探討了ING4 的作用機制，結果發現，通過慢病毒轉染上調

ING4

的表達還可以降低宮頸癌細胞CaSki 中β-catenin、c-myc 蛋白的相對 表 達 量。β-catenin 是 經 典WNT/β-catenin 信 號通路的調控因子，其表達水平的高低與WNT/βcatenin 信號通路的激活水平直接相關。

c

-

myc

是位于WNT/β-catenin 信號通路的下游基因，WNT/β-catenin 信號通路激活可以促進c-myc 蛋白的表達。本實驗結果顯示，上調

ING4

的表達能夠抑制宮頸癌細胞CaSki 中WNT/β-catenin 信號通路激活。既往研究發現，WNT/β-catenin 信號通路在惡性腫瘤中過度激活，其活化水平升高可以促進惡性腫瘤的進展，阻斷WNT/β-catenin 信號通路可以抑制腫瘤細胞的生長并誘導細胞凋亡。本實驗發現，WNT/β-catenin 信號通路激活劑LiCl可以逆轉上調

ING4

對宮頸癌細胞增殖抑制和凋亡促進的作用，表明上調

ING4

的表達可能通過調控WNT/β-catenin 信號通路影響宮頸癌細胞的增殖和凋亡。既往研究報道顯示，ING4 作用機制與細胞內多種信號通路有關，其可以通過影響WNT 信號轉導通路調控A549 細胞的生長過程。本實驗結果表明，ING4 參與宮頸癌進展可能與WNT/βcatenin 信號通路有關。

綜上所述，ING4 在宮頸癌中表達下調，ING4能夠抑制宮頸癌細胞的增殖并誘導其凋亡，其作用機制可能與下調WNT/β-catenin 信號激活程度有關，這為今后進一步研究ING4 在宮頸癌進展中的作用和具體調控機制提供了參考資料。