鄒永妮，楊健，武君華

1西安天博醫(yī)學(xué)檢驗實驗室實驗中心，西安 710018

2空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院血液內(nèi)科，西安 710038

3西安市中心血站白細(xì)胞研究室，西安 710000

近年來胰腺癌的發(fā)病率和病死率不斷升高，在過去的幾十年中，胰腺癌患者的5 年生存率幾乎沒有變化，且胰腺癌的診斷和治療仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)，生物標(biāo)志物的應(yīng)用有助于確定治療方法，也為改善預(yù)后提供了機會。因此，探索胰腺癌的發(fā)展機制和新的治療靶點具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等非編碼RNA均在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其可用于胰腺癌的診斷和治療，在臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景。研究報道，基因間長鏈非編碼RNA00963（long intergenic non-protein coding RNA 963，LINC00963）在食管癌組織中的表達(dá)顯著增加，且與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期及不良預(yù)后有關(guān)；敲低LINC00963 的表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞增殖、體外侵襲及體內(nèi)腫瘤生長。LINC00963表達(dá)升高與患者的預(yù)后不良有關(guān)，其可通過抑制miRNA-204-3p/纖連蛋白1（fibronectin 1，F(xiàn)N1）通路促進骨肉瘤的增殖和侵襲。LINC00963 通過使腫瘤抑制因子miRNA-542-3p 海綿化促進核仁蛋白2（nucleolar protein 2，NOP2）表達(dá)，從而促進前列腺癌的轉(zhuǎn)移。然而LINC00963 對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及調(diào)控機制尚不清楚。在前列腺癌細(xì)胞系和人前列腺癌中，miRNA-511-3p 表達(dá)顯著下調(diào)，慢病毒誘導(dǎo)的miRNA-511-3p 表達(dá)上調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。研究表明，LINC02163 可通過抑制miRNA-511-3p 的表達(dá)促進結(jié)直腸癌的進展。然而LINC00963是否通過調(diào)控miRNA-511-3p 影響胰腺癌進展目前尚不清楚。因此，本研究旨在探討LINC00963 對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其調(diào)控機制是否與miRNA-511-3p有關(guān)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

正常胰腺上皮細(xì)胞hTERT-HPNE 和胰腺癌細(xì)胞系Capan-1、SW1990 均購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司，胰腺癌細(xì)胞系PaTu8988 購自上海雅吉生物科技有限公司。RPMI-1640 培養(yǎng)基購自上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，熒光定量試劑盒購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，RIPA 蛋白裂解液購自北京百奧萊博科技有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購自北京凱瑞基生物科技有限公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）購自上海易匯生物科技有限公司，Transwell 小室和Matrigel 均購自上海子起生物科技有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組

應(yīng)用RPMI-1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)正常胰腺上皮細(xì)胞hTERT-HPNE 和胰腺癌細(xì)胞系Capan-1、SW1990、PaTu8988，分別將si-NC、si-LINC00963、pcDNA-NC、pcDNA-LINC00963、miRNA-NC、miRNA-511-3p、anti-miRNA-NC、anti-miRNA-511-3p 轉(zhuǎn)染至Capan-1 細(xì)胞中，記為si-NC 組、si-LINC00963組、pcDNA-NC 組、pcDNA-LINC00963 組、miRNANC 組、miRNA-511-3p 組、anti-miRNA-NC 組、antimiRNA-511-3p 組；分 別 將si-LINC00963 與antimiRNA-NC、anti-miRNA-511-3p 共轉(zhuǎn)染至Capan-1細(xì)胞中，記為si-LINC00963+anti-miRNA-NC 組、si-LINC00963+anti-miRNA-511-3p 組；正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC 組。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測LINC00963和miRNA-511-3p 的表達(dá)水平

提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說明書進行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），反應(yīng)條件：95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個循環(huán)。LINC00963 和miRNA-511-3p 分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和

U6

基因為內(nèi)參。LINC00963 上游引物序列為5'-GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT-3'，下游引物序列為5'-ACGTGGATGACAGCGTGTGA-3'；

GAPDH

上游引物序列為5'- CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，下游引物序列為5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'；miRNA-511-3p 上游引物序列為5'-AGACAGAAAACGATGTGTAA-3'，下游引物序列為5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；

U6

上游引物序列為5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用2法計算LINC00963 和miRNA-511-3p 相對表達(dá)量。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9 的表達(dá)水平

提取總蛋白，采用BCA 試劑盒定量，將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，再分別加入一抗和二抗孵育，采用電化學(xué)發(fā)光液顯影，成像后應(yīng)用Quantity One 軟件測定蛋白條帶灰度值，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參計算cyclin D1、MMP2、MMP9 相對表達(dá)量。

1.5 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖

將1.2 中的各組Capan-1 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，添加10 μl CCK-8 溶液，孵育2 h，應(yīng)用SpectraMax M5酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的光密度（A）值，以A 值代表細(xì)胞活性。

1.6 Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲

取1.2 中各組對數(shù)生長期細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞遷移實驗：將200 μl Capan-1細(xì)胞懸液和600 μl RPMI-1640 完全培養(yǎng)液分別加入至Transwell 小室的上室和下室，培養(yǎng)24 h 后應(yīng)用多聚甲醛固定，并采用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照，計算遷移細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞侵襲實驗：采用Matrigel 包被Transwell 小室的上室，之后的操作與細(xì)胞遷移實驗相同。

1.7 雙熒光素酶報告實驗檢測LINC00963 和miRNA-511-3p 的靶向調(diào)控關(guān)系

構(gòu)建含有miRNA- 511- 3p 結(jié)合位點的LINC00963 野生型及突變型報告基因載體，在Capan- 1 細(xì) 胞 中 轉(zhuǎn) 染miRNA- 511- 3p mimics 和LINC00963 野生型及突變型報告基因載體，按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常胰腺上皮細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞系中LINC00963 和miRNA-511-3p 相對表達(dá)量的比較

胰腺癌細(xì)胞系Capan-1、SW1990、PaTu8988 中LINC00963 相對表達(dá)量均高于正常胰腺上皮細(xì)胞hTERT-HPNE，miRNA-511-3p 相對表達(dá)量均低于正常胰腺上皮細(xì)胞hTERT-HPNE，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.05）。（表1）

表1 不同細(xì)胞系中LINC00963 和miRNA-511-3p 相對表達(dá)量的比較（±s）

2.2 LINC00963 低表達(dá)對Capan-1 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

NC 組、si-NC 組、si-LINC00963 組Capan-1 細(xì)胞中LINC00963、cyclin D1、MMP2、MMP9 相對表達(dá)量及A 值、細(xì)胞遷移數(shù)目、細(xì)胞侵襲數(shù)目比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.01）。si-LINC00963 組Capan-1 細(xì) 胞 中LINC00963、cyclin D1、MMP2、MMP9 相對表達(dá)量均低于si-NC 組，細(xì)胞活性（A值）低于si-NC 組，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均少于si-NC 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.05）。（圖1、圖2、表2）

圖1 Western blot檢測NC組、si-NC組、si-LINC00963組Capan-1細(xì)胞中cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)情況

圖2 Transwell實驗檢測NC組、si-NC組、si-LINC00963組Capan-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

表2 NC 組、si-NC 組、si-LINC00963 組Capan-1 細(xì)胞中LINC00963、cyclin D1、MMP2、MMP9 相對表達(dá)量及細(xì)胞增殖、遷移和侵襲情況的比較（±s）

2.3 miRNA-511-3p 高表達(dá)對Capan-1 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

miRNA-511-3p 組中miRNA-511-3p 相對表達(dá)量 明 顯 高 于miRNA-NC 組，cyclin D1、MMP2、MMP9 相對表達(dá)量均明顯低于miRNA-NC 組，A 值明顯低于miRNA-NC 組，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均明顯少于miRNA-NC 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.01）。（表3、圖3、圖4）

圖3 Western blot檢測miRNA-NC組、miRNA-511-3p組Capan-1細(xì)胞中cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)情況

圖4 Transwell實驗檢測miRNA-NC組、miRNA-511-3p組Capan-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

表3 miRNA-NC 組和miRNA-511-3p 組Capan-1 細(xì)胞中miRNA-511-3p、cyclin D1、MMP2、MMP9 相對表達(dá)量及細(xì)胞增殖、遷移和侵襲情況的比較（±s）

2.4 LINC00963 靶向調(diào)控miRNA-511-3p 的表達(dá)

Starbase 預(yù)測顯示LINC00963 和miRNA-511-3P 具 有 結(jié) 合 位 點（圖5）。miRNA-511-3p 與LINC00963 野生型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后Capan-1 細(xì)胞的熒光素酶活性明顯低于miRNA- NC 與LINC00963 野生型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的Capan-1 細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.01），而miRNA-511-3p或miRNA-NC 與LINC00963 突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹥0.05）（表4）。si-LINC00963 組中miRNA-511- 3p 相對表達(dá)量高于si- NC 組，pcDNALINC00963組中miRNA-511-3p相對表達(dá)量低于pcDNA-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.05）（表5）。

圖5 Starbase對LINC00963和miRNA-511-3p結(jié)合位點進行預(yù)測的示意圖

表4 miRNA-NC 或miRNA-511-3p 與LINC00963 野生型及突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Capan-1 細(xì)胞后雙熒光素酶活性的比較（±s）

表5 不同組別Capan-1 細(xì)胞中miRNA-511-3p 相對表達(dá)量的比較（±s）

2.5 miRNA-511-3p 低表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)LINC00963低表達(dá)對Capan-1 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

anti-miRNA-511-3p 組中miRNA-511-3p 相對表達(dá)量低于anti-miRNA-NC 組，cyclin D1、MMP2、MMP9 相對表達(dá)量均高于anti-miRNA-NC 組，A 值高于anti-miRNA-NC 組，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均多于anti-miRNA-NC 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.05）；si-LINC00963+anti-miRNA-511-3p 組中miRNA-511-3p 相對表達(dá)量低于si-LINC00963+antimiRNA-NC 組，cyclin D1、MMP2、MMP9 相對表達(dá)量均高于si-LINC00963+anti-miRNA-NC 組，A 值高于si-LINC00963+anti-miRNA-NC組，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均多于si-LINC00963+anti-miRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.05）。（圖6、圖7、表6）

表6 anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-511-3p組、si-LINC00963+anti-miRNA-NC組、si-LINC00963+anti-miRNA-511-3p組Capan-1細(xì)胞中miRNA-511-3p、cyclin D1、MMP2、MMP9 相對表達(dá)量及細(xì)胞增殖、遷移和侵襲情況的比較（±s）

圖6 Western blot檢測anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-511-3p組、si-LINC00963+anti-miRNA-NC、si-LINC00963+anti-miRNA-511-3p組Capan-1細(xì)胞中cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)情況

圖7 Transwell實驗檢測anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-511-3p組、si-LINC00963+anti-miRNA-NC組、si-LINC00963+antimiRNA-511-3p組Capan-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

3 討論

胰腺癌是惡性程度最高的消化道腫瘤，具有發(fā)病癥狀不明顯、早期診斷困難、進展迅速以及預(yù)后差等特點，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，近年來分子靶向治療在胰腺癌的治療領(lǐng)域取得了一定進展，靶向治療已成為治療胰腺癌的新方法。研究表明，lncRNA 可參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。研究報道，LINC00963 在乳腺癌組織中過表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期和分化程度有關(guān)；沉默LINC00963 的表達(dá)可通過調(diào)控miRNA-625-高遷移率族蛋白A1（high mobility group protein A1，HMGA1）抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進體外細(xì)胞凋亡。LINC00963 通過激活磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）途徑促進肝癌細(xì)胞的增殖。LINC00963 通過miRNA-124-3p/卷曲蛋白受體4（frizzled class receptor 4，F(xiàn)ZD4）途徑促進結(jié)直腸癌的增殖和遷移。LINC00963 還能夠通過miRNA-608/伏隔核蛋白1（nucleus accumbens associated 1，NACC1）途徑促進黑色素瘤的進展，并且能夠預(yù)測不良預(yù)后。以上研究表明，LINC00963 在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用。本研究結(jié)果顯示，與正常胰腺上皮細(xì)胞hTERT-HPNE 比較，胰腺癌細(xì)胞系Capan-1、SW1990、PaTu8988 中LINC00963 表達(dá)水平升高，表明LINC00963 在胰腺癌中也可能發(fā)揮促癌作用。本研究結(jié)果還顯示，降低LINC00963 的表達(dá)水平后，cyclin D1、MMP2、MMP9 表達(dá)水平均降低，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均減少，表明LINC00963 低表達(dá)可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

研究表明，lncRNA 可通過調(diào)控miRNA 海綿化影響惡性腫瘤進展，如ZFPM2 反義RNA 1（ZFPM2 antisense RNA 1，ZFPM2-AS1）可通過調(diào)控miRNA-511-3p 參與肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移過程。ZFPM2-AS1 還能夠通過調(diào)控miRNA-511-3p 影響宮頸癌的惡性程度。另有研究表明，LINC02163 能夠通過調(diào)節(jié)miRNA-511-3p 的表達(dá)加速乳腺癌的惡性腫瘤行為。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞系中miRNA-511-3p 低表達(dá)，提高miRNA-511-3p 的表達(dá)水平可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此外，LINC00963 能夠靶向調(diào)控miRNA-511-3p，miRNA-511-3p 低表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)LINC00963 低表達(dá)對Capan-1 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

綜上所述，低表達(dá)LINC00963通過靶向上調(diào)miRNA-511-3p的表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。