干熱條件下大豆分離蛋白-殼寡糖美拉德反應及產物表征

李康昱，姜 玲，滕 靜，徐真真，肖軍霞

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島 266109）

大豆分離蛋白（Soybean protein isolate，SPI）是以低溫脫溶大豆粕為原料加工生產的一種蛋白，具有起泡性、乳化性等功能[1]，由于其價格低廉并具有較高的營養價值，被廣泛應用于食品工業。然而，大豆分離蛋白的溶解性及其他部分功能特性較差，對加工條件（高溫、pH 等）敏感，這在很大程度上限制了其在諸多食品體系中的應用[2]。因此，對SPI 進行改性對于拓展其在食品工業中的應用具有重要意義。目前已被用于蛋白質改性的方法有物理法、化學法和酶法，其中化學改性法中的美拉德反應具有安全性好、效果顯著等優點因而受到廣泛的關注[3]。

美拉德反應（Maillard reaction, MR），又稱非酶褐變反應、羰氨縮合反應[4]，是指蛋白質、多肽、氨基酸等含氨基化合物與含羰基化合物之間通過復雜的反應生成蛋白質/多糖綴合物及其它產物的過程。美拉德反應的進程、產物性質及產物類型等受反應時間[5]、反應溫度[6]、參與反應底物類型[7]及反應體系pH[8]等諸多因素的影響。目前已有關于利用美拉德反應對SPI 進行改性的報道，例如：Ashaolu 等[9]發現SPI 與秋葵膳食纖維之間的美拉德反應產物具有較高的EAI 和ESI，并且具有穩定Pickering 乳液的能力；丁欣悅[10]研究了SPI 與半乳糖/葡萄糖/果糖之間的美拉德反應，發現SPI 的溶解性、乳化性、內源熒光強度均增加。

殼寡糖（Chitosan oligosaccharide,COS）是殼聚糖水解后的一種低聚糖，是一種雙功能試劑，既能與蛋白質[11]發生美拉德反應，又能與糖[12]發生美拉德反應，由于較殼聚糖具有更好的溶解性、抗菌性等功能性質，已在食藥領域獲得廣泛應用[12?13]。Zheng等[14]對COS 和乳清分離蛋白之間的美拉德反應進行了研究，發現反應后蛋白質的溶解度和乳化性能均得到明顯改善，因此，有必要就SPI 與COS 之間的美拉德反應進行系統研究。目前尚未見到SPI 與COS 之間的美拉德反應的報道。

傳統的蛋白質與糖發生美拉德反應的方法有兩種：干熱法[15]和濕熱法[16]。但是濕熱法工藝較為繁瑣，設備投資較高，能源消耗較大，這在很大程度上限制了美拉德反應在SPI 改性中的實際應用[17]。因此，本論文采用干熱法制備SPI 與COS 的美拉德反應產物，利用高效液相色譜儀（High performance liquid chromatography, HPLC）測定不同反應產物的糠氨酸（Furosine，FML）和5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furaldehyde，HMF）含量以監測美拉德反應的進程；利用熱重分析儀（Thermo gravimetric analyzer，TGA）測定美拉德反應的熱穩定性；利用熒光分光光度計（Fluorescence spectrophotometer）研究蛋白質的熒光強度變化，同時測定了美拉德反應物的溶解性、乳化性等性質，這為將COS 用于SPI 的美拉德反應改性提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPI 食品級，臨沂禹王植物蛋白有限公司；COS 食品級，青島海匯生物工程有限公司；FML 標準品（純度99.9%）和HMF 標準品（純度99.9%）德國Polypeptide 公司；鄰苯二甲醛 化學純，上海國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250 分析純，上海邁坤化工有限公司；大豆油 食品級，山東盛達食品有限公司；十二烷基硫酸鈉 分析純，天津博迪化工股份有限公司；所有其他化學品和試劑 均為分析級或更高級別。

TGA 2-SF 熱重分析儀、Delta320pH 計 瑞士梅特勒-托利多股份有限公司；IKA 數顯式高速分散機 上海圣科儀器設備有限公司；LC-20AT 高效液相色譜儀 島津（中國）有限公司；ZEN3690 激光粒度分布儀 英國馬爾文實驗設備公司；F-2700 熒光分光光度計 日本日立公司；SPS401F 萬分之一分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；UV-2000 紫外分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；FDU-1200 真空冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPI-COS 反應產物的制備 SPI 與COS 分別按照16:1、12:1、8:1、4:1、1:1 的質量比混合，用蒸餾水充分溶解，使SPI 的質量濃度達到4%（w/v），然后用1 mol/L 的NaOH 溶液或HCl 溶液調節pH 至8.0，于恒溫磁力攪拌器中充分混合，混合液置于?20 ℃冰箱冷凍后用真空冷凍干燥機凍干12 h，樣品用研缽研磨5 min 后置于干燥器內備用。

將凍干后的SPI-COS 混合物（Mixture）置于康威氏皿內室，外室以飽和KCl 溶液提供（80.3%±0.5%）的相對濕度，置于80 ℃恒溫干燥箱內反應12 h。測定不同質量比下所得美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）的相關指標。

1.2.2 褐變程度的測定 取一定量的MRPs，加入相應體積的蒸餾水定容，保持SPI 的濃度為4%（w/v），充分攪拌后，以4000 r/min 離心10 min，取上清液測定290 nm 及420 nm 下的吸光值作為褐變程度的指標，以相同質量濃度的COS 水溶液為參比。

1.2.3 游離氨基酸含量的測定 采用鄰苯二甲醛（Ophthalaldehyde, OPA）法[18]測定其游離氨基酸含量。

取相應質量的MRPs 和混合物，按照1.2.2 中方法處理，上清液200 μL 加入4 mL OPA 試劑，40 ℃下儲存2 min，在340 nm 處測吸光值。用L-賴氨酸（0.25～2 mmol/L）代替樣品進行測定，繪制標準曲線，經計算得到游離氨基酸含量。根據下式計算游離氨基酸損失率：

式中：W1：SPI-COS 混合物中游離氨基酸含量，mmol/L；W2：MRPs 中游離氨基酸含量，mmol/L。

1.2.4 FML 含量的測定 按照文獻[19]的方法通過HPLC 法測定MRPs 中FML 的含量。

稱取MPRs 0.25 g 置于水解管中，加入6 mL 濃鹽酸，充入氮氣封口后于110 ℃下水解23 h。將冷卻后的水解液過濾，收集濾液。取0.5 mL 濾液于SPE-C18萃取柱中，當液面降至固相表面時，加入5 mL 3mol/L HCl 溶液洗脫，收集洗脫液。用移液槍移取400 μL 洗脫液于真空干燥機內干燥，干燥后的樣品加入400 μL 水:乙腈:甲酸混合液（體積比為94.8:5:0.2）溶解，過0.22 μm 有機濾器過濾后采用RP-HPLC 法測定FML 含量。

HPLC 法測定條件：色譜柱：Agilent zorbax SBC18（4.6 mm×250mm，5 μm）；流動相：A：以5 mmol/L庚烷磺酸鈉配制的2%甲醇溶液；B：乙腈；檢測波長：280 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；流速：0.35 mL/min；洗脫程序：0～20 min：100% B；20～40 min：89% A，11% B。

1.2.5 HMF 含量的測定 按照文獻[20]中的方法測定MRPs 中HMF 的含量。

稱取0.20 g MPRs，加入5 mL 0.15 mol/L 草酸溶液，混合均勻，分別加入3 mL 濃度為92 g/L 的鐵氰化鉀溶液和濃度為183 g/L 的乙酸鋅溶液，充分震蕩后靜置10 min，用甲醇定容至50 mL，混勻、過濾，收集濾液，取1 mL 濾液過0.45 μm 有機濾器后采用HPLC 法測定HMF 含量。

HPLC 法測定條件：色譜柱：Agilent zorbax SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相:甲醇:水（體積比15:85）；檢測波長：285 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min。

1.2.6 Zeta-電位的測定 將MRPs 和混合物用去離子水溶解，使溶液中SPI 的濃度達到4%（w/v），取1 mL 溶液注入ZEN3690 馬爾文動態光散射儀的樣品池中，于室溫下測定Zeta-電位。

1.2.7 可溶性蛋白含量的測定 可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G250 法[21]。將MPRs 和混合物以1.2.2 中的方法進行處理，上清液適當稀釋后取0.1 mL 加入5 mL 100 μg/mL 的考馬斯亮藍G250溶液，振蕩均勻，2 min 后測定595 nm 處的吸光值，根據標準曲線計算可溶性蛋白含量。

1.2.8 乳化性能的測定 按照文獻[22]的方法稍加改進。分別取0.03 g MRPs 和混合物，加入12 mL 蒸餾水和4 mL 大豆油，置于高速均質機下10000 r/min攪拌5 min。分別在0 min 和10 min 時取樣，用0.1%十二烷基硫酸鈉溶液稀釋相應倍數，以0.1%十二烷基硫酸鈉溶液為空白，于500 nm 處測定其吸光值。根據下式計算乳化活性指數（Emulsification activity index, EAI）及乳化穩定性指數（Emulsification stability index, ESI）：占體積分數；L-比色皿光程；A0-0 min 時500 nm 處的吸光值；A10-10 min 時500 nm 處的吸光值

1.2.9 熱性能分析 分別取3 mg MRPs 和混合物，加入熱重分析儀樣品盒內，以速率為10 ℃/min 從30 ℃加熱至500 ℃，通過TGA 分析軟件得到樣品的TGA 及DTG 曲線。1.2.10 熒光光譜分析 取MRPs 和混合物溶于pH7.0 的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中，充分攪拌后以3000 r/min 離心10 min，以考馬斯亮藍G250 法測定上清液可溶性蛋白含量，進行適當稀釋使得所測MRPs 溶液中可溶性蛋白濃度一致。設定激發波長為334 nm，以5 nm 為間隔在350～500 nm 波長范圍內進行掃描。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 褐變程度的分析

290 nm 和420 nm 下的吸光值分別是美拉德反應中間階段及最終階段產物的評價指標之一,且反應程度與顏色正相關[23]。由圖1 所示，在SPI:COS=16:1 和12:1 時，MRPs 在290 nm 和420 nm 下 的吸光值變化不顯著；當質量比為8:1 時，MRPs 在290 nm 和420 nm 下的吸光值顯著上升（P<0.05），并隨COS 比例的增加而顯著增大（P<0.05）。這主要是由于底物中COS 的含量較低時，反應過程中與SPI 的結合不夠充分，而隨著COS 含量的增加，體系中的美拉德反應程度也隨之增加。因此，選擇褐變程度較明顯的8:1、4:1、1:1 三個SPI:COS 比例進行后續研究。

圖1 SPI 與COS 質量比對MRPs 420 nm 和290 nm 處吸光值的影響Fig.1 Effect of SPI/COS mass ratio on the absorbance of MRPs at 420 nm and 294 nm

2.2 游離氨基酸含量的分析

美拉德反應的本質是氨基與羰基發生羰氨縮合，因此可通過測定游離氨基酸的含量來判斷美拉德反應的進程。由圖2 可知，在不同比例下MRPs 中的游離氨基含量均遠遠低于混合物中的游離氨基含量，這表明各組均發生了不同程度的美拉德反應。在所選定的比例范圍內，隨著COS 在混合物中所占比例的增大，其與SPI 混合物中的游離氨基酸含量隨之增大。而在SPI 與COS 質量比由8:1 變為4:1 時，其MRPs 中的游離氨基酸的損失率由86.24%增長至87.66%，當SPI 與COS 的質量比由4:1 變為1:1 時其損失率由87.66%增長至93.50%，這說明較4:1 而言，當COS 添加至1:1 時，其美拉德反應程度有著顯著提高。Seo 等[24]指出，美拉德反應中短鏈碳水化合物比例較高時，其反應活性較高，這一結論在本研究中得以驗證。

圖2 SPI 與COS 質量比對MRPs 游離氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of SPI/COS mass ratio on free amino acid content of MRPs

2.3 FML 和HMF 的分析

由于早期美拉德反應產物轉變成的FML 在280 nm 下有強烈的紫外吸收峰[25]，可通過HPLC 測定其含量，從而判斷美拉德反應早期階段重排產物的生成量，進一步反映出美拉德反應早期階段的反應程度[26]。由圖3（a）可知，當SPI 與COS 以8:1 混合時其產物中的FML 含量較低為485.04 μg/g，這可能由于COS 的含量較低，體系中美拉德反應不充分所導致的；而隨著COS 的增加，SPI 與COS 的質量比達到4:1 時，其產物中的FML 含量上升至1844.54 μg/g，這是由于隨著COS 含量的增加，體系中美拉德反應速率增加，進而導致測得的FML 含量上升；而當SPI 與COS 質量比達到1:1 時，其產物中的FML含量下降至698.58 μg/g，說明隨著COS 的加入，體系中美拉德反應速率增快，總反應此時處于高級階段，大部分FML 發生降解。

HMF 是美拉德反應中期的產物[27]。HMF 主要來源于美拉德反應過程中乳糖基賴氨酸的分解，而乳糖基賴氨酸的來源是美拉德反應初級階段的產物糠氨酸[28]，因此美拉德反應速率越快時生成的HMF 越多。由圖3（b）可知，SPI 與COS 的質量比為8:1 和4:1時，MRPs 中HMF 的含量無顯著差異；4:1 時最高為297.96 μg/g，但是當該比例變為1:1 時，HMF 的含量顯著降低至243.68 μg/g，表明此時COS 過量，導致美拉德反應中間產物HMF 下降。

圖3 SPI 與COS 質量比對MRPs 中FML（a）和HMF（b）含量的影響Fig.3 Effect of SPI/COS mass ratio on FML(a) and HMF(b)contents in MRPs

綜上所示，反應中FML 與HMF 的含量隨著COS含量的增大呈現“鐘形”變化趨勢，表明在本研究范圍內體系中美拉德反應速率隨COS 的增加而增快。

2.4 Zeta-電位的分析

Zeta-電位的絕對值可以反映膠束穩定性，一般認為Zeta-電位絕對值大于30 mV 時粒子間的斥力會使膠體體系保持穩定。如圖4 所示，不同質量比下的SPI 與COS 混合物隨著COS 比例增加而電負性降低，且MRPs 的電負性均比混合物要增強，當質量比為8:1 時，MRPs 的Zeta-電位達到?33.8 mV，當質量比為4:1 時，Zeta-電位顯著上升至?15.2 mV，而在4:1 到1:1 的變化范圍內MRPs 的Zeta-電位變化不顯著。這主要是因為COS 自身帶正電荷使得混合物電負性降低，另一方面是美拉德反應后生成了電負性強的產物以及游離的COS 含量降低導致體系電負性增強。因此，SPI 與COS 之間的美拉德反應可以有效提高SPI-COS 體系的穩定性。

圖4 SPI 與COS 質量比對MRPs 中Zeta-電位的影響Fig.4 Effect of SPI/COS mass ratio on Zeta-potential in MRPs

2.5 可溶性蛋白含量的分析

由圖5 可知，隨著反應體系中COS 含量的增加，MRPs 中可溶性蛋白的含量逐漸降低，這一現象在質量比為4:1 時最為顯著（P<0.05），較SPI-COS混合物降低了約97.3%。這可能是80 ℃的高溫處理使SPI 發生變性，破壞了蛋白質的高級結構，多肽鏈的展開使疏水基團暴露，在疏水作用驅動下形成較大的聚集體，難以均勻分散到以水為介質的體系中，從而表現為可溶性蛋白含量的降低。王天宇[29]的研究發現，在SPI 提取過程中的pH 回調階段添加的葡萄糖越多，其MRPs 的溶解性越低。這說明SPI 與COS 之間的美拉德反應在體系中產生了難溶性物質，導致SPI 的溶解性降低。

圖5 SPI 與COS 質量比對MRPs 可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of SPI/COS mass ratio on soluble protein content of MRPs

2.6 乳化性能的分析

由圖6 可知，在所有質量比下，MRPs 的EAI 和ESI 均高于混合物，說明了SPI 與COS 之間的美拉德反應提高了SPI 的乳化能力。MRPs 的EAI 隨COS 的增高而降低，在SPI:COS 質量比為1:1、4:1、8:1 時，較混合物分別提高了153.7%、383.9%、509.3%，這一方面是由于COS 引入使溶液表現出較高的黏性；另一方面是由于SPI 含量較高時美拉德反應程度相對較低，反應后期生成的不溶性小分子含量較低，形成的蛋白質-糖復合物具有更好的界面性質。這說明COS 的引入有效的提高了SPI 的乳化活力。Wen 等[30]在傳統濕熱法的基礎上用超聲輔助的方法對SPI 與香菇多糖之間的美拉德反應的進行研究，發現SPI-香菇多糖復合物的EAI 較SPI 提高了180.52%，也印證了這一結論。

圖6 SPI 與COS 質量比對MRPsEAI 和ESI 的影響Fig.6 Effect of SPI/COS mass ratio on EAI and ESI of MRPs

MRPs 的ESI 值隨COS 的添加先顯著增大后顯著減小。當SPI:COS 為8:1 時，MRPs 的ESI 較低，較混合物提高了33.3%，這主要是因為COS 比例較低時，美拉德反應程度較小，對SPI 的改性不夠充分；當SPI:COS 為4:1 時最為穩定，ESI 較混合物提高了183.3%，這說明通過控制COS 的添加量來控制美拉德反應程度從而提高SPI 乳化穩定性。李良等[31]發現SPI 與葡聚糖之間的美拉德反應提高了SPI 的乳化穩定性，也進一步印證了這一觀點。

綜上所述，SPI 與COS 之間的美拉德反應有效的提高了SPI 的EAI 和ESI，其中，質量比為8:1時MRPs 的乳化活力最強；質量比為4:1 時MPRs的乳化穩定性最好。

2.7 熱性能分析

熱重分析通常應用于研究大分子物質及其復合的熱穩定性、分解、脫水、氧化以及揮發物質組分分析。熱分解過程可分為三個階段，階段Ⅰ主要為105 ℃之內，此階段為樣品的失水過程；階段Ⅱ（105～450 ℃）為樣品中未發生美拉德反應的糖的分解過程；階段Ⅲ（450 ℃以上）主要為未反應的SPI 及MRPs 反生的熱分解過程[32]。

SPI 與COS 的質量比對所得美拉德反應產物的熱穩定性有著重要的影響，由圖7（a）可知，當質量比為8:1、4:1、1:1 時，MRPs 的質量保留率分別為36.88%、38.80%和42.76%，均低于相應的混合物，這可能是因為美拉德反應過程中產生了加熱易分解的糖基化產物，Fu 等[33]在研究SPI 與5 kDa 低聚殼聚糖的反應中也得到了相同的結論。隨著COS 的增加而MRPs 的質量保留率也呈逐漸上升的趨勢，這是由于隨著COS 的增加而美拉德反應更充分，生成了更多的熱穩定性高的高分子糖基化產物，導致其熱穩定性也隨之增加。

圖7 SPI 與COS 質量比對MRPsTGA（a）、DTG（b）圖譜的影響Fig.7 Effect of SPI/COS mass ratio on TGA (a),DTG (b) of MRPs

由圖7（b）可知，當SPI:COS=1:1 時，混合物的最大質量損失溫度為280 ℃，而MRPs 的最大質量損失溫度上升至295 ℃，這說明SPI 與COS 之間發生的美拉德反應生成了新的物質；在對MRPs 的分析中，當SPI 與COS 的質量比由1:1 變為4:1 和8:1 時，其最大質量損失溫度升高至305 ℃，這由于此時反應處在熱分解的階段Ⅱ，體系中發生熱分解的主要是未發生美拉德反應的COS，相較于1:1 時，在4:1 和8:1 的條件下由于底物中的COS 含量較低，導致未發生美拉德反應COS 降低，進而導致最大損失溫度升高。考慮到SPI 的最大質量損失溫度為315 ℃，也進一步推測SPI 與COS 之間的美拉德反應形成的糖基化物質的熱穩定性不如SPI。

2.8 熒光光譜的分析

美拉德反應進程中會生成熒光中間產物[34]。由圖8 可知，SPI 與COS 的質量比對混合物以及MPRs中的熒光強度有顯著影響，混合物、MPPs 的熒光強度均隨著COS 的增加呈先降低后增加的變化趨勢。與混合物相比，MPRs 的熒光強度均增強，這說明美拉德反應產生了熒光性中間產物。張志凱等[35]發現SPI 與木糖之間的美拉德反應也顯著提高了SPI 的熒光強度，這與本文的結論一致。

圖8 SPI 與COS 質量比對MRPs 熒光強度的影響Fig.8 Effect of SPI/COS mass ratio on fluorescence intensity of MRPs

美拉德反應產物的熒光光譜特征為激發波長310～350 nm，發射波長為400～440 nm[36]，不同于蛋白質其激發波長為290 nm、發射波長為336 nm 的熒光性[37]。SPI 與COS 的質量比為8:1、4:1、1:1時，在未加熱的狀態下測得混合物的λmax分別為403、410 nm 和436 nm；MRPs 的λmax分別為417、430 nm 和422 nm，這均符合美拉德反應的熒光特征，說明在未加熱的情況下SPI 與COS 均發生了輕微的美拉德反應，加熱促進了SPI 與COS 發生美拉德反應生成熒光性中間產物。Xu 等[38]在研究反應時間對SPI 和葡萄糖美拉德反應影響的進程中測得不同的λmax，基于該結果，作者得出結論，反應過程中生成了不同的熒光化合物；因此，SPI 與COS 之間美拉德反應所呈現的λmax變化趨勢，主要是由于COS 添加量的不同，導致美拉德反應處于不同階段，反應過程中生成的活性熒光化合物之間不斷發生聚合反應，形成了多種熒光物質；另一方面，也與體系中SPI 與COS 自身發生的美拉德反應有關。

3 結論

探討了不同質量比的SPI 與COS 在干熱條件下的美拉德反應及其反應產物的功能特性。SPI:COS 質量比為8:1、4:1、1:1 時，MRPs 的褐變程度比較明顯，且反應程度隨COS 比例的增加而增加；SPI:COS 為8:1 時MRPs 的Zeta-電位達到了?33.8 mV，說明美拉德反應提高了SPI-COS 體系的穩定性；MRPs 的溶解性較SPI-COS 混合物顯著降低；美拉德反應顯著提高了SPI 的乳化活性和乳化穩定性，SPI:COS 質量比為8:1 和4:1 時，MRPs的EAI 和ESI 最高，較SPI-COS 混合物分別提高了509.3%和183.3%；在熱性能分析中，MRPs 的熱穩定性不如SPI；熒光光譜的結果表明，美拉德反應增強了SPI-COS 體系的熒光強度并形成了多種熒光物質。因此，SPI 與COS 之間的美拉德反應為開發新型食品基料、改善SPI 功能性開辟了一條新的途徑。