自噬在脂多糖引發的心肌損傷中的作用機制及中醫藥研究

江艷艷 王曉平 李偉利 田雪 姜茜茜 孫乾斌 張倩 馬林 王偉 李春 王勇

摘要 膿毒癥引發的心肌損傷是重癥監護病房膿毒癥患者死亡的主要原因之一。通過研究脂多糖（LPS）誘導的膿毒癥致心肌損傷模型，探討保護心肌損傷的治療方法與策略，能為臨床治療膿毒癥引起的心肌損傷提供實驗依據。自噬通常被認為是降解多余、受損的細胞成分實現物質循環再利用的調節機制，在保護心肌細胞結構和功能方面發揮重要的調控作用。最新研究發現自噬失衡是引發心臟毒性損傷的關鍵機制，而通過自噬調節可以改善LPS引發的心肌損傷。現系統梳理自噬信號通路在LPS引發的心肌損傷中的作用機制及中醫藥治療的研究進展，為膿毒癥引起的心肌損傷的治療提供新的思路和方法。

關鍵詞 自噬;自噬通量;脂多糖;膿毒癥;心肌損傷;中藥復方;雙熒光標記;中醫藥

Abstract Myocardial injury caused by sepsis is one of the leading causes of death in patients with sepsis in intensive care units.Studying the model of myocardial injury induced by Lipopolysaccharide（LPS）and exploring the therapeutic methods and strategies for myocardial injury can provide experiment basis for clinical treatment of myocardial injury induced by sepsis.Autophagy is generally considered to be a regulatory mechanism that degrades excess and damaged cell components to realize material recycling and reuse，and plays an important regulatory role in protecting the structure and function of cardiomyocytes.The latest research has found that autophagy imbalance is the key mechanism leading to cardiotoxic damage.The regulation of autophagy can improve myocardial damage caused by LPS.This paper aims to systematically sort out the mechanism of autophagy signaling pathway in myocardial injury caused by LPS and the research progress of traditional Chinese medicine treatment，and provide new ideas and methods for the treatment of myocardial injury caused by sepsis.

Keywords Autophagy; Autophagy flux; Lipopolysaccharide; Sepsis; Myocardial Injury; Chinese medicine compound; Double fluorescent labeling; Traditional Chinese medicine

中圖分類號：R228文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.025

膿毒癥是由細菌、真菌或病毒引起的感染性疾病，嚴重時會導致器官功能障礙[1]，其中以心臟功能障礙最為多見，但其機制尚未完全闡明[2]。大量實驗研究采用腹腔注射脂多糖（LPS）建立膿毒型心肌損傷模型，進而模擬臨床膿毒癥情況下心肌損傷的病理特征并研究其具體機制。LPS是革蘭陰性細菌細胞壁外壁的組成成分，由3個通過共價鍵連接的結構域組成，包括脂A的糖脂部分、糖鏈以及核心低聚糖[3]。其中脂A被稱為內毒素，是LPS的毒性成分，可以顯著促進炎癥和免疫應答反應。作為目前研究最多的細菌免疫刺激成分之一，LPS很難從細胞壁脫落，當細菌死亡時它會通過溶解、破壞細胞來脫落[4]。研究表明當LPS進入機體后，游離的LPS可以與免疫細胞相互作用，并誘導炎癥介質、促凋亡因子和促纖維化因子等的釋放，導致心臟冠狀動脈血流減少，心律失常，心臟前負荷、后負荷改變等變化，直接損傷心肌細胞，影響心功能[5]，造成心肌纖維化和心肌梗死等心臟疾病[6-7]。盡管現代醫學在危重癥的分子生物學方面已經取得了重大進展，但心功能障礙依舊是膿毒癥患者死亡的主要原因之一[8]。最新研究表明，LPS刺激會導致機體內細胞自噬水平的變化，其中心臟自噬的改變尤為顯著。自噬作為細胞在應激狀態下將自身受損或衰老的細胞器和錯誤折疊的蛋白降解以維持自身能量需求的一種適應性反應，在其失調時同樣會對細胞產生有害作用[9]。因此深入探討自噬在LPS誘導的心臟損傷中的作用機制以及基于自噬調控的治療方法具有重要的臨床意義。

1 自噬的分類

在哺乳動物細胞中，自噬有2種不同的分類方法：1）根據細胞內底物運送到溶酶體腔方式的不同分為3種主要類型：大自噬，微自噬和伴侶介導的自噬[10]。2）根據自噬對降解底物的選擇性分為兩類：選擇性自噬和非選擇性自噬[10]。盡管每種自噬在形態上不同，但最終都會將底物運送至溶酶體進行降解和再循環。大自噬依賴于自噬體的形成，包裹底物運送至溶酶體;微自噬是通過溶酶體膜的內陷直接吸收底物;分子伴侶介導的自噬直接將未折疊的蛋白質轉運通過溶酶體膜[11]。現代研究目前主要集中在大自噬（下文所指自噬），具體過程分以下幾個階段進行：包括分隔膜的初步形成及延展、吞噬小泡的形成、自噬體成熟和底物隔離、自噬體-溶酶體膜融合以及自噬溶酶體的內容物被溶酶體內水解酶降解，最終自噬溶酶體的降解物被釋放以進行物質循環[12]。線粒體自噬（Mitophagy）是選擇性自噬的一種，其對受損或衰老線粒體的選擇性降解在維持能量穩態和減少由功能障礙線粒體產生的活性氧和線粒體DNA方面起著重要作用[13]。線粒體作為細胞中的能量供應器對心肌細胞至關重要。一些研究發現LPS會損害心肌細胞線粒體，通過調節線粒體自噬水平能減緩LPS誘導的心肌損傷[14-15]。然而自噬在LPS誘導的心肌病中的具體機制還需進一步研究。

2 自噬的過程及調節因子

自噬的誘因復雜，主要分為胞內和胞外，胞內信號來源于損傷、衰老的細胞器及長壽命蛋白等，胞外信號包括缺氧、饑餓、生長因子（如胰島素、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板來源增殖因子以及生長激素釋放抑制因子等）等[12]。自噬的調節因子也十分多樣，在特定條件下，自噬對調節因子傳導的環境信號做出反應[16]。1）饑餓是一種有效的自噬生理調節因子，可以通過哺乳動物雷帕霉素靶點蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）調控自噬，mTOR主要包括大分子復合物mTORC1[17]。2）另外生長因子刺激Ⅰ類磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（Protein Kinase B，PKB）途徑或其他營養相關信號（如亮氨酸），激活mTORC1負調控UNC-51激酶1復合物（ULK1、ATG13、ATG101和FIP200）;相反，能量耗竭則抑制mTORC1，允許激活ULK1介導的自噬關鍵起始步驟[18]。程序性死亡受體-1（Beclin1）與膜泡分揀蛋白34（Vacuolar Protein Sorting 34，VPS34）及VPS15形成復合物啟動自噬體的形成[19];隨后其他自噬相關蛋白（Autophagy Related Proteins，ATG）被募集以促進膜的延伸，許多ATG蛋白在酵母和哺乳動物之間是保守的，并參與泛素樣結合系統（該系統包括泛素激酶E1的Atg7，2個泛素結合酶E2的Atg10和Atg3，以及2個泛素類蛋白Atg8和Atg12，對自噬泡的成熟和包裹物的招募具有重要作用）形成自噬體，自噬體延伸需要2個泛素樣結合系統：ATG5-ATG12結合系統和微管結合蛋白輕鏈3（Microtubule-associated Protein 1A/1B-light Chain 3-ATG8）結合系統;當膜結構進一步延展時，自噬體與底物上的受體或銜接蛋白結合，以促進底物進入自噬體;隨后包裹底物的自噬體在相關分子Rab（Rab5、Rab7）、UVRAG、SNARE等的作用下與溶酶體融合，在溶酶體水解酶作用下降解底物實現物質再循環。溶酶體的生物活性和功能取決于溶酶體內環境酸堿度、溶酶體水解酶活性及溶酶體相關蛋白LAMP1、LAMP2的調節[20]。

3 自噬信號通路

自噬信號通路有很多報道，目前對自噬信號通路的研究主要集中在：1）mTOR信號通路;2）腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated Protein Kinase，AMPK）信號通路;3）Beclin1-Bcl-2（Bcl2，B細胞淋巴瘤-2，抑制凋亡的線粒體內膜蛋白）信號通路;4）轉錄因子EB（Transcription Factor EB，TFEB）信號通路。

3.1 mTOR信號通路 作為自噬負性調控因子中研究的熱點，mTOR是進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能與多種結合蛋白相互作用，其中研究較多的mTORC1由mTOR、RAPTOR、PRAS40、DEPTOR、MLST8等組成[21]。mTORC1調控自噬的機制包括：1）直接磷酸化ULK1的Ser757位點進而抑制ULK1的活性，抑制自噬體的形成[11];2）磷酸化AMBRA1（自噬/Beclin1調控因子）進而抑制ULK1穩定性，抑制自噬體的形成[22];3）磷酸化PI3K復合物中的Atg14進而抑制自噬體的形成[23];4）抑制TFEB的核定位進而抑制溶酶體相關基因的轉錄，抑制自噬溶酶體的形成及降解[24]。mTORC1的上游信號包括：1）胰島素或生長因子信號主要通過PI3K-AKT-TSC復合物-RHEB激活mTORC1[23];2）活化的AKT直接磷酸化抑制PRAS40（mTORC1的抑制蛋白激酶），從而激活mTORC1抑制自噬[25]。在LPS誘導的心肌損傷中，通過激活mTOR通路，調節自噬可以保護心肌細胞。如Han等[26]研究發現阿托伐他汀（Atorvastatin）通過抑制mTOR上游蛋白AKT，mTOR和mTOR下游核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）的磷酸化促進自噬，改善LPS誘導的炎癥反應，保護心臟。Zhou等[27]發現在LPS誘導的腸道上皮炎癥模型中，通過抑制mTOR的活性激活Atg5促進自噬小體的形成，會減輕LPS誘導的腸道上皮細胞炎癥反應。

3.2 AMPK信號通路 AMPK是一個高度保守的激酶，通過協調多種代謝通路來維持全身能量代謝的穩態[28]。以α，β，和γ異源三聚體的形式存在于多種組織中，其亞基的多個位點可通過被磷酸化和去磷酸化而發揮自噬調節作用[29]。AMPK調控自噬的機制包括：1）磷酸化TSC2和RAPTOR抑制mTORC1，從而促進自噬[30-31];2）直接磷酸化UKL1的Ser555和Ser317位點，激活ULK1，進而啟動自噬體的形成;3）激活FOXO3，TFEB和BRD4等轉錄因子的表達間接促進自噬[32];4）調節細胞周期負性調控因子p27Kip1的磷酸化而促進自噬[33]。AMPK的上游信號包括：1）缺氧時，細胞內AMP或ADP水平升高，AMP或ADP可以與AMPK的γ亞基結合激活AMPK[34];2）肝激酶B1（Liver Kinase B1，LKB1），鈣調蛋白依賴性蛋白激酶酶β（CaMKKβ）以及轉化生長因子激活酶（TGFβ-activated Kinase，TbAK1）也可激活AMPK[35-37]。研究發現通過AMPK通路調節心肌自噬水平可以對抗LPS誘導的心肌損傷。如Zhang等[38]發現LPS可以明顯促進心肌細胞中AMPK上游調節因子蛋白磷酸酶2（PP2A）和蛋白磷酸酶2C（PP2C）的表達抑制AMPK，激活mTOR，從而改變心肌細胞自噬水平。

3.3 Beclin1-Bcl-2信號通路 Beclin 1是酵母自噬相關蛋白Atg6與Vps30在哺乳動物中的同源物，與PI3K-Ⅲ相互作用產生磷脂酰肌醇3-磷酸（Phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P），PI3P是自噬小體形成所必需的效應蛋白[39]。抗凋亡蛋白Bcl-2能與Beclin1相互作用，調節細胞內的自噬水平[40]。Beclin1-Bcl-2調節自噬的機制為：正常情況下，Beclin1與液泡蛋白分選蛋白（Vacuolar Protein Sorting，Vps34），p150，Atg14三者結合形成復合物，Bcl-2通過BH3結構域與Beclin1相互作用，抑制Beclin1活性，從而抑制Beclin1介導的自噬;在缺氧或饑餓等應激條件下，Bcl-2會與Beclin1復合物解離，誘導Beclin1引起的自噬[41]。研究發現在受到外界刺激時，負調控自噬活性的Bcl-2家族蛋白（Bcl-2/XL）可以被各種激酶（包括DAPK、ROCK1、Mst1和JNK1）調控，促進其與Beclin1的解離誘導自噬[42]。Sun等[43]的研究發現在LPS誘導的心肌損傷模型中，通過調節Beclin 1的表達改善細胞自噬水平會減輕LPS誘導的心肌損傷。

3.4 轉錄因子EB（Transcription Factor EB，TFEB）信號通路 TFEB是自噬的主要轉錄調控因子之一，它促進自噬體形成、溶酶體生物發生，是溶酶體功能的關鍵調控因子[44]。在饑餓或溶酶體功能障礙的情況下，TFEB被磷酸化，進而迅速轉移到細胞核并激活其靶基因的轉錄[45]。TFEB調控自噬的機制包括：1）直接與協調溶酶體表達和調控的基序結合，促進包含其啟動子調控基序的整個基因網絡的表達，增加溶酶體數量和溶酶體酶的釋放[46-47];2）與眾多自噬基因的啟動子區域結合，并誘導自噬體生物發生和自噬體溶酶體融合;3）TFEB過表達還可以導致大體積自噬底物（如長壽蛋白）的降解增強、脂滴清除和線粒體損傷;4）參與調節特異性細胞器自噬，如脂噬和線粒體自噬[45]。許多研究發現通過調控TFEB的磷酸化水平來控制細胞自噬水平，對疾病的發生發展有良好的調節作用。如Kim等[48]研究發現通過CO激活蛋白激酶R（PKR）樣內質網激酶（PERK）和Ca2+水平和鈣調磷酸酶活性，增加了TFEB的核轉運，提高了鼠肝細胞和肝組織中線粒體自噬的水平和溶酶體基因Lamp1、CathB、TPP1等的表達。

雖然LPS調節自噬的機制尚未完全闡明，但許多研究證實傳統中藥通過多途徑調節心肌細胞mTOR、AMPK以及自噬體形成關鍵蛋白的水平，有望保護心肌細胞對抗LPS誘導的心肌損傷[38，49]。

4 自噬與LPS誘導心肌損傷的關系

LPS引起的膿毒癥造成的急性休克和心肌損傷，一直是臨床醫生和科學家高度關注的問題，然而其致病機制尚未明確。許多研究已經探討了LPS誘導的心肌損傷的分子機制，先前的研究表明炎癥反應，微循環受損和細胞病變性缺氧是LPS誘導心臟損傷的重要病因[50-51]。而隨著自噬在應激狀態下維持細胞內環境穩態和保護心肌細胞的作用被重視，自噬調控逐漸成為了治療膿毒癥中心肌損傷的關鍵機制[17，52]。

最近的研究發現LPS刺激產生的過量炎癥介質會引起小鼠心肌自噬水平發生顯著變化[53]。然而不同研究者對小鼠心肌自噬水平的變化有不同的觀點：一些研究者認為自噬是細胞在應激狀態下的適應性反應，通過提高心肌細胞自噬通量可以對抗LPS誘導的心肌損傷，如Pan等[54]研究發現褪黑素可以調節線粒體解偶聯蛋白（UCP），提高LPS誘導的心肌細胞自噬水平，保護線粒體的結構和功能，緩解LPS誘導的心肌損傷;Unuma等[55]發現鈷原卟啉可以激活心肌細胞TFEB和LAMP蛋白促進自噬體形成，保護心肌細胞，緩解LPS誘導的心肌損傷。也有研究者認為LPS誘導的心肌細胞自噬是過度自噬會損害心肌細胞，如Li等[56]認為LPS誘導的心肌細胞自噬是過量的，他們發現一種重要的生物活性肽阿拉曼定（Alamandine）可以在一定程度上抑制LPS處理小鼠心臟中Atg3和Atg5 mRNA水平的升高，減少LPS誘導的微管結合蛋白輕鏈3（Microtubule-associated Protein 1A/1B-light Chain 3，MAP-LC3）的增加，降低LPS處理鼠的自噬水平的強烈增加，減弱LPS對小鼠心臟結構和功能的破壞。LPS刺激劑量、刺激方式及刺激時間以及判斷自噬水平的監測方法的差異，均會導致自噬調控結果在同一膿毒癥模型中的表現不一致。尤其是針對自噬水平的判斷，多數研究集中于自噬相關蛋白表達量的研究，而自噬是一個動態且復雜的過程，需要對其整體通量進行綜合評估。如在研究自噬水平時，通過自噬指示蛋白的表達量來反映細胞的自噬水平是片面的，應在自噬指示蛋白表達水平研究的基礎上，進一步綜合采用GFP-mRFP-LC3雙熒光標記、電鏡等方法，對自噬通量即包括自噬體、自噬溶酶體以及溶酶體活性等多個環節與角度進行綜合評估進而判斷自噬通量[57]。同時，研究自噬通量的時間點也因研究目的不同而異。因此，應建立LPS刺激的劑量梯度和時間梯度，以檢測并繪制心肌細胞在體自噬水平變化。綜合以上的研究將為通過干預自噬治療LPS引起的心肌損傷的最佳給藥時間及給藥劑量提供指導。

5 中藥在LPS引發心肌損傷中的研究進展

根據《國際膿毒癥和感染性休克管理指南》2016版[58]，針對LPS引發的心肌損傷強烈建議盡快開始抗菌治療，這是由于在治療膿毒癥或膿毒癥休克時，每延遲1 h使用抗生素，都可能導致死亡率增加。然而抗生素作為現代醫學普遍認可的治療膿毒癥的藥物，其對膿毒癥引起的心肌損傷未見有效[51]。而且臨床對抗生素的使用有嚴格要求，如具有安全一次性或快速輸液優勢的β-內酰胺類抗生素，雖可迅速進入血液發揮抗炎、抗菌作用，減輕患者全身及各器官膿毒癥反應，但大量、長時間服用會產生耐藥性和不良反應（如雙硫侖樣作用），因此其使用劑量和時間有一定限制。除了盡快開始抗生素治療外，機械通氣、糾正低氧和酸中毒、維持血壓和心輸出量等均是治療膿毒癥引起心肌損傷的重要治療方式[59]，使用相應的治療心血管損傷的藥物，可減輕心肌損傷，但此類藥物只是單純的對癥治療，對膿毒癥引發的心肌損傷仍有局限作用。近來有研究顯示二甲雙胍（Metformin）、生物活性肽（Alamandine）和右美托咪定（Dexmedetomidine）等藥物均可通過調控心肌細胞自噬，進而減輕LPS誘導的心肌損傷[56，60-61]。但這些藥物的具體作用機制尚未完全闡明，且未應用于臨床。因此需要我們繼續尋找和探索既能保護LPS誘導心肌損傷同時不良反應小的新藥。

中醫藥在預防和治療LPS誘導的心肌損傷中有巨大潛力，研究證實部分中藥復方、單味藥及活性成分可通過抗炎、抗心肌纖維化、抗氧化、抗凋亡等不同途徑減輕LPS誘導的心肌損傷。中藥復方如：1）強心一號復方由水紅花子、黃芪、茯苓、丹參和五味子組成[62]，通過抑制膿毒癥小鼠心肌細胞凋亡改善病理性心肌肥大;2）傳統中藥復方四逆湯由附子（制）、干姜、炙甘草組成，可降低膿毒癥中晚期大鼠心肌細胞中TNF-α、IL-10等炎癥介質的表達水平，改變大鼠體內炎癥介質大量釋放的狀態，糾正大鼠心肌的免疫紊亂，從而減輕膿毒癥大鼠心肌損傷[63-64]。單味藥如：1）人參和西洋參，分別為五加科人參屬植物人參和西洋參的根，可補氣滋陰，提高機體免疫力，降低小鼠心肌細胞NADPH氧化酶2（NOX2）表達水平，從而使心肌細胞炎癥介質超氧陰離子（O2-）以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的生成減少，減輕LPS引發的心肌損傷[65];2）紅花，為菊科植物紅花的干燥花，常用來治療心臟病和炎癥，可以激活抗凋亡蛋白Bcl-2和p-Bad，下調Bax、細胞色素C、凋亡蛋白酶（Caspase-9、Caspase-3）和凋亡誘導因子表達，激活胰島素樣生長因子受體信號通路，抑制LPS誘導的H9C2心肌細胞凋亡[7]。中藥活性成分如：1）麝香酮來源于麝科動物林麝或原麝成熟雄體香囊中的干燥分泌物麝香，可以顯著下調膿毒癥小鼠IL-1β、TNF-α和IL-6等炎癥介質的水平，抑制核因子κB，NLRP3炎性小體的活性，減輕心肌梗死后心臟組織巨噬細胞介導的炎癥反應，保護心肌梗死后心臟組織[66];2）楊梅素（Myricetin）為楊梅科植物楊梅的樹皮中提取的一種黃酮醇類化合物，能抑制一氧化氮合酶（iNOS）的過表達和氧化還原酶（SOD和GPx）活性的降低，通過抗炎，抗氧化減輕LPS誘導的心肌損傷[67];3）蘆丁又稱蕓香苷，廣泛存在于植物的花和果實中，具有抗氧化、抗炎的作用，可以減少LPS誘導的心肌纖維化[68];4）丹參酮ⅡA磺酸鈉（Sodium TanshinoneⅡA Sulfonate）為唇形科植物丹參的根提取分離得到的二萜醌類化合物，可以減緩LPS誘導的家兔血流動力學惡化，調節炎癥介質分泌，減輕LPS造成的心肌損傷[69]。

近年來隨著自噬研究的深入，自噬在維持心臟結構和功能中關鍵作用已被確認，以上藥物能否通過調節自噬保護LPS誘導的心肌損傷具有極大的研究價值。另外其他具有心肌保護作用的中藥復方及其提取物，如：丹參酮ⅡA、黃芪甲苷、木犀草素、紫荊黃酮、葒草苷、木酚素、丹酚酸B、加味丹參飲、芪丹理心丸、芪藶強心等，在不同心肌損傷模型中通過影響細胞自噬水平進而治療心肌損傷的效果也被證實[57，70-74]，但能否通過調節自噬水平治療LPS誘導的心肌損傷尚未得到證實。

6 討論

自噬水平的改變是LPS誘導心肌損傷的重要病理改變，調節心臟自噬水平的變化能緩解LPS誘導的心肌損傷。最新研究提示，體內注射LPS導致心肌細胞內自噬流的迅速變化，自噬水平的變化與心肌的結構和功能密切相關。而通過多渠道調節心肌自噬水平顯著減輕了LPS誘導的心肌損傷，這為臨床治療LPS引起的膿毒癥提供了理論基礎。傳統中藥能通過不同機制調節自噬，保護多種原因引起的心肌損傷。然而無論是從機制還是從藥物篩選上，應用中藥調節心肌自噬水平治療膿毒癥引起的心肌損傷的研究都十分缺乏，仍需進一步探索。

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（2020-09-01收稿 責任編輯：楊覺雄）