基于轉錄組測序技術探討活血降糖飲干預糖尿病腎病的機制

劉雪梅 劉德亮 曾霖 李惠林 趙恒俠 張學文

摘要 目的：探討活血降糖飲治療糖尿病腎病的分子機制。方法：通過高脂飼料喂養加尾靜脈注射鏈脈佐菌素（STZ）等建立糖尿病腎病大鼠模型，并將模型大鼠隨機分為糖尿病腎病（DN）組、模型+雙胍+中藥組（DN+Met+ZY）、模型+雙胍+卡托普利組（DN+Met+CP），給予相應藥物進行灌胃治療，并另設正常對照組，每組10只，干預16周后，觀察各組大鼠空腹血糖（FBG）、血脂、血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、24 h尿總蛋白（24 h UTP）及尿微量清蛋白（24 h mALB）的變化。觀察腎組織病理改變，并對各組腎組織進行RNA-seq測序。結果：與模型組比較，中藥組和卡托普利組可以顯著下調糖尿病腎病大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB等水平，而HDL-C無明顯變化;與卡托普利組之間比較，中藥組FBG、TC、TG、LDL-C明顯下降，HDL-c、Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB均無明顯差別。與模型組比較，中藥組和卡托普利組均可以顯著改善糖尿病腎病大鼠的腎臟病理學變化。轉錄組測序結果顯示模型組對比正常組與中藥組對比模型組轉錄本中基因總量接近，其中表達差異最明顯的雙向調控基因共篩選出10個;京都基因與基因組百科全書（KEGG）前20條顯著富集通路分析顯示模型組對比正常組與中藥組對比模型組共同作用的信號通路有代謝相關通路及cAMP信號通路。結論：活血降糖飲聯合二甲雙胍能改善糖尿病腎病大鼠的糖脂代謝紊亂，減少尿白蛋白的排泄，改善腎功能和腎臟病理改變，延緩糖尿病腎病病情進展，其作用機制可能是通過Cftr、Pdk4、Angptl4、Hmgcs2等多靶點介導多通路實現的。

關鍵詞 活血降糖飲;糖尿病腎病;轉錄組測序技術;二甲雙胍;糖尿病;鏈脲佐菌素;卡托普利

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Huoxue Jiangtang Decoction in the treatment of diabetic nephropathy.Methods：The diabetic nephropathy model was established by feeding high fat diet and injecting streptozotocin （STZ） through tail vein.The model rats were randomly divided into a diabetic nephropathy （DN） group，a model+biguanide+traditional Chinese medicine （DN+Met+ZY） model+biguanide+captopril （DN+Met+CP） group.The corresponding drugs were given by gavage，and another normal control group was set up，with 10 rats in each group.The changes of fasting blood glucose （FBG），blood lipid，serum urea nitrogen （BUN），serum creatinine （SCR），24 h urinary protein （24 h UTP） and urinary microalbumin （24h mAlb） were observed.The pathological changes of renal tissue were observed，and RNA-seq sequencing was performed in each group.Results：Compared with the model group，the levels of FBG，TC，TG，LDL-C，SCR，bun，24 h UTP and 24 h mAlb were significantly decreased in the Chinese medicine group and captopril group，but HDL-C had no significant change; compared with captopril group，FBG，TC，TG and LDL-C in Chinese medicine group decreased significantly，while there were no significant difference in HDL-C，SCR，bun，24 h UTP and 24 h mAlb.Compared with the model group，the Chinese medicine group and captopril group can significantly improve the renal pathological changes of diabetic nephropathy rats.The results of transcriptome sequencing showed that the total number of genes in the transcripts of model group vs normal group and traditional Chinese medicine group vs model group was close，and 10 bidirectional regulatory genes with the most obvious expression difference were screened out; the analysis of the first 20 KEGG rich pathways showed that the metabolic pathway and cAMP signaling pathway were involved in the model group vs the normal group and the Chinese medicine group vs the model group.Conclusion：Huoxue Jiangtang Drink combined with metformin can improve the disorder of glucose and lipid metabolism，reduce the excretion of urinary albumin，improve renal function and pathological changes，and delay the progression of diabetic nephropathy.Its mechanism may be mediated by multiple pathways such as CFTR，PDK4，ANGPTL4 and hmgcs2 etc.

Keywords Huoxue Jiangtang Decoction; Diabetic nephropathy; Transcriptome sequencing technology; Metformin; Diabetes; Streptozotocin;Captopril

中圖分類號：R255.4;R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.012

糖尿病是一種常見的內分泌代謝異常性疾病，以持續性高血糖為特征，是到目前為止影響人類健康的一大慢性非傳染性疾病。其發病率隨著生活水平的不斷提高而逐步上升。而糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一，在糖尿病患者中的發病率為20%～40%[1]，是導致終末期腎衰竭最常見的原因。DN發病機制復雜，至今仍未明了，是多因素共同作用的結果，所導致的主要病理改變為腎臟肥大、腎小球和腎小管基底膜（GBM）增厚、細胞外基質（ECM）蛋白積聚致系膜區擴張，最終導致彌漫性或結節性腎小球硬化及腎小管間質纖維化。目前對于DN的研究認為，其發病可能與以下幾個機制有關：1）糖代謝異常導致的多元醇通路激活、蛋白激酶C的活化以及糖基化終產物的形成和堆積，導致早期腎小球高濾過、后期腎小球硬化[2-3];2）高糖引起高滲透壓導致腎血流量改變，腎小球內皮細胞和上皮細胞損傷，AngⅡ、TGF-β過度表達，導致細胞外基質增加，腎小球硬化[4];3）糖尿病時，體內多種炎癥介質導致腎小球損傷、加速腎小球硬化[5-6];4）其他因素包括氧化應激、細胞凋亡、黏附分子等都參與DN的發生發展全過程。

目前治療DN主要是通過生活方式的改變以及控制血糖、血脂、血壓等加重DN病情的危險因素，并采用血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）降低腎小球壓力以減少蛋白尿的生成，而并無特效藥物。因此，尋求更多DN的治療方法實有必要。前期研究發現活血降糖飲能改善糖脂代謝及胰島素抵抗，提高胰島素敏感性，同時還能改善腎功能，緩解DN進展[7-9]。本研究初步探討活血降糖飲對氣陰兩虛夾瘀型早期DN的可能作用機制;通過基礎研究發現活血降糖飲能有效干預DN的生物信息學證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取健康SPF級Wistar雄性大鼠，4周齡，共40只，體質量（170±10）g，均由中山大學動物中心，動物許可證號SCXK（粵）2016-0029。動物自由攝食、飲水，標準實驗環境下飼養。普通飲水和基礎飼料均由廣州永諾生物科技有限公司提供。本研究已通過廣東省深圳市中醫院倫理審查[倫理審批號：倫理發（2020年）8號]。

1.1.2 藥物 活血降糖飲（黃芪、太子參、丹參各30 g，牡丹皮、紅花、山藥各10 g，生地黃20 g，五味子、麥冬、黃精、熟大黃各15 g）由深圳市中醫院制劑室協助煎煮、過濾，濃縮成含生藥4 g/mL，4 ℃冰箱保存備用。二甲雙胍為上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產的原料藥，用滅菌注射用水配制為25 mg/mL的溶液;卡托普利為上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產的原料藥，用滅菌注射用水配制為1.75 mg/mL的溶液。

1.3 試劑與儀器 血糖試劑（批號：SBJ-R0122）、血脂試劑（批號：SBJ-R0794）、尿素氮試劑（批號：SBJ-H2001）、肌酐（批號：SBJ-H1998）等試劑盒均購自羅氏公司;鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，美國，貨號：S0130）;磷酸鹽緩沖液（PBS）（博士德公司，貨號：AR0194-10）;檸檬酸鹽緩沖液（批號：Q101977）、二甲苯（批號：2650-17-1）、無水乙醇（批號：E111963）、氯仿（批號：67-66-3）、異丙醇（批號：67-63-0）均購自廣州化學試劑廠;蘇木精染色液（廣州市秀威貿易有限公司，貨號：SY1438）;糖原PAS染色液試劑盒（批號：20170925）、Masson三色染色試劑盒（批號：G1340）均購自Solarbio公司;Trizol（美國MRC公司，美國，貨號：TR118-100）。血糖儀（強生公司，美國，型號：穩擇易ONETOUCH）;全自動生化分析儀（羅氏公司，美國，型號：cobas 8000 c702）;顯微鏡OPTEC CCD TP510（奧特公司，美國，型號：OPTEC）;冷凍離心機（德國Eppendorf公司，德國，型號：5424R）;干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司，型號：GY-2101）;微量定量檢測儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號：000001）;電泳儀（上海天能儀器有限公司，型號：EPS 600）;水平電泳槽（北京六一儀器有限公司，型號：DYCP-31A型）;凝膠成像系統（上海天能儀器有限公司，型號：Tanon-5200Multi）;2100生物分析儀（中國Agilent公司，型號：Agilent2100）;PCR儀（中國東勝龍儀器有限公司，型號：ETC811）;迷你離心機（杭州奧盛儀器有限公司，型號：Mini-15k）;渦旋振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司，型號：MTV-1）;電子顯微鏡（上海易匯生物科技有限公司，型號：XTX-3C/NTB-2B）;電子顯微鏡（日本電子株式會社，日本，型號：JEM-1400 PLUS）;冰箱（Thermo公司，美國，型號：Thermo Scientific-80 ℃）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠普通飼料適應性喂養1周后，稱體質量，隨機取10只作為正常組，制備模型大鼠30只。模型大鼠持續高脂喂養，正常組大鼠普通飼料喂養，4周后，模型大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）（30 mg/kg）（溶于0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液，現配現用），正常組大鼠尾靜脈注射等體積的檸檬酸緩沖液。1周后，所有大鼠禁食12 h，麻醉后眼眶后靜脈叢采血測空腹血糖（FBG）。FBG>16.7 mmol/L者，且按上述喂養方法2周后同樣方法再次測FBG>16.7 mmol/L則認為造模成功。

1.2.2 給藥方法 造模成功后，模型大鼠分為3組（每組10只）和正常大鼠10只，共有如下4組：1）正常組（Control）;2）模型組（DN）;3）模型+二甲雙胍+中藥（DN+Met+ZY）;4）模型+二甲雙胍+卡托普利組（DN+Met+Cap）。中藥按4 g/（kg·d）、二甲雙胍按250 mg/（kg·d）、卡托普利按17.5 mg/（kg·d）灌胃給藥，每周灌胃6 d，1次/d，期間正常喂食，記錄各組大鼠體質量、進食量、飲水量等變化，給藥16周后，監測大鼠的FBG、24 h尿蛋白（24 h UTP）含量;1周后，禁食24 h，所有大鼠腹主動脈采血后處死，收集血液、兩側腎皮質。及尿微量清蛋白（24 h mALB）。

1.2.3 觀察指標與方法

1.2.3.1 一般生化指標檢測 各組大鼠腹主動脈采血，收集血液樣本離心、取血清，用酶法及膽固醇氧化酶法檢測FBG、血脂代謝指標（TC、TG、LDL-C、HDL-C）以及血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），并在羅氏全自動生化分析儀上進行檢測。24 h UTP及24 h mALB均用免疫比濁法。

1.2.3.2 觀察腎皮質病理的改變 取一側腎皮質，分為2部分，其中一部分腎皮質在固定、石蠟包埋后，進行HE染色、PAS染色、Masson染色，觀察病理改變。

1.2.3.3 觀察腎小球超微結構的改變 另一部分腎皮質通過透射電鏡觀察腎小球超微結構的改變。用鋒利刀片切取目標病變部位的腎皮質組織塊約1 mm3，不超米粒樣大小，經2.5%中性戊二醛溶液前固定2 h、0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗、1%鋨酸后固定1.5～2 h、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗、梯度脫水、樹脂滲透、包埋、固化、半薄切片定位、超薄切片、鈾鉛雙染色等各步驟后，用電子顯微鏡觀察目標結構、調試電鏡至圖像清晰，采集需要的圖像。

1.2.3.4 RNA-seq測序

選擇正常組、模型組、模型+二甲雙胍+中藥組3組的另一側腎皮質組織置-80 ℃冰箱，進行RNA-seq測序。

1.2.3.4.1 組織細胞Total RNA的提取 取樣本25～50 mg，于研缽中液氮研磨成為粉末，轉移至預先加入1 mL Trizol 1.5 mL EP管內，迅速顛倒混勻。棄培養基，加入適量1×PBS（2 mL/25 mm 2培養瓶）洗滌細胞1遍。棄1×PBS，加入1 mL Trizol，反復吹打培養瓶底部以使細胞裂解脫落，收集于1.5 mL離心管，用力震蕩混勻。加入200 μL氯仿，上下用力顛倒混勻30 s，靜置3 min。4 ℃，12 000×g離心15 min。此時可見裂解液分3層：上層水相的RNA;中層為DNA、脂類等;下層為細胞殘渣、蛋白、多糖等。取上清500 μL到新的EP管內，167 μL吸3次;加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10 min后，4 ℃，12 000×g離心10 min。小心去掉上清，注意不要丟失RNA沉淀，加入1 mL 75%乙醇，上下顛倒，使沉淀塊重懸起。4 ℃，12 000×g離心10 min，小心去掉上清，盡量吸干管壁的液體，注意不要丟失RNA沉淀，若沉淀松動可再次離心。晾干約15 min，至管壁無液體。加入適量體積（20～100 μL）的DEPC-H2O溶解RNA，58 ℃水浴10 min。取樣1 μL進行分光光度計檢測，500 ng進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，500 ng進行安捷倫2100生物分析儀檢測，剩余Total RNA樣本置于-80 ℃保存。

1.2.3.4.2 mRNA建庫 經RNA提取、mRNA分離及片段化、一鏈cDNA合成、二鏈合成、二鏈產物純化、末端修復與加dA尾、Adapter連接、連接產物純化、片段選擇、PCR、PCR產物純化后建立mRNA庫。

1.2.3.4.3 Illumina HiSeqTM2000測序 由Illumina HiSeqTM2000測序得到數據Raw Reads，隨后要對Raw Reads進行質量控制（QC），以確定測序數據是否適用于后續分析，質控后，經過濾得到Clean Reads，用比對軟件將Clean Reads比對到參考序列。比對完，通過統計Reads在參考序列上的分布情況及覆蓋度，判斷比對結果是否通過第2次質量控制（QC of alignment）。

1.2.3.5 基因表達量和差異表達基因分析 運用SOAP[10]軟件將通過檢測的這些Clean Reads高效、準確地比對到大鼠參考基因組序列上去，并用RSEM軟件計算每個基因的表達量，采用基于泊松分布原理的PossionDis法篩選差異表達基因[11]。

1.2.3.6 生物信息學分析 選擇大鼠腎皮質組織不同樣本間差異表達的基因進行基因功能（GO）富集分析和信號通路（Pathway）富集分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，先行方差齊性檢驗，方差齊采用F檢驗進行總均值比較、SNK法進行兩兩比較;方差不齊改用Welch檢驗進行總體均值比較、Dunnett-t檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般生化指標檢測結果

2.1.1 各組大鼠糖脂代謝指標的比較 與正常組比較，模型組大鼠的FBG、TG、TC、LDL-C等水平顯著上升（P<0.01），而HDL-C則顯著下降（P<0.01）;與模型組比較，模型+雙胍+中藥組和模型+雙胍+卡托普利組的FBG、TG、TC、LDL-C等水平顯著下降（P<0.01），而HDL-C水平則無顯著變化。見表1。

2.1.2 各組大鼠腎臟相關指標的比較 與正常組比較，模型組大鼠的Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB等水平顯著上升（P<0.01）;與模型組比較，模型+雙胍+中藥組和模型+雙胍+卡托普利組的Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB等水平顯著上升（P<0.01）。見表2。

2.2 大鼠腎皮質HE染色、PAS染色、Masson染色結果 1）HE染色主要看組織結構的完整性以及病理情況，其結果顯示：正常組腎組織結構排列緊密，腎小球、腎小管形體結構正常;模型組腎臟病變明顯，腎小球基底膜增厚，胞外基質、系膜基質積聚。各給藥組（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）較模型組病理變化有所改善，給藥各組之間變化不明顯。2）Masson染色主要看組織發生纖維化程度，膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色，其結果顯示：正常組腎組織中無明顯藍色，即存在極少量的膠原纖維。模型組存在較多膠原纖維，說明DN促使腎組織發生纖維化。各給藥組（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）腎組織的膠原纖維較模型組少，給藥組之間腎組織膠原纖維表達無差別。3）PAS染色是觀察腎臟結構，尤其是腎小球系膜、基底膜以及腎小管結構的主要方法，紫紅色深淺代表糖原或多糖的含量高低，其結果顯示：模型組腎組織多糖和糖原表達比正常組表達明顯增加，呈紫紅色。各給藥組（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）腎組織多糖或糖原的表達均比模型組表達量減少，給藥組之間腎組織多糖或糖原的表達相近。綜上所述，DN大鼠模型造模成功，模型+二甲雙胍+中藥組、模型+二甲雙胍+卡托普利組均能改善腎組織病理變化，且二者差異無統計學意義。見圖1。

2.3 大鼠腎小球超微結構透射電鏡觀察結果 電鏡結果顯示，正常組大鼠腎組織中腎小球毛細血管基底膜厚度平均為138.8 nm，足細胞排列整齊。模型組大鼠腎小球基底膜均勻增厚，其最大值達354.26 nm，平均值為284.43 nm，約為正常組基底膜平均值的2倍。模型組腎足細胞發生融合，無電子致密物質沉積。與模型組比較，各給藥組（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）大鼠的腎小球基底膜厚度均勻降低，足細胞融合度明顯減少。見表3，圖2～3。

2.4 轉錄組測序實驗及生信分析結果

2.4.1 表達差異分析 模型組與正常組比較，轉錄本中共計13 345基因，其中可以找到6 626個顯著上調基因，6 719個顯著下調基因;模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組，轉錄本中共計13 316個基因，其中可以找到6 480個顯著上調基因，6 836個顯著下調基因。見圖4～5。

2.4.2 差異表達最為明顯的雙向調控基因 篩選出同時滿足模型組對比正常組下調而模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組上調的差異表達最為明顯的雙向調控基因共計6個，同時滿足模型組對比正常組上調而模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組下調的差異表達最為明顯的雙向調控基因共計4個。見圖6～7。

2.4.3 差異表達基因GO富集分析結果 模型組對比正常組差異表達基因主要注釋到生物學過程類別，包括細胞過程、單生物體過程、生物調節、代謝途徑、刺激應答、多細胞生物體過程等;細胞組分類別主要包括細胞、細胞組成、細胞器、細胞膜、膜組成、細胞器組成、胞外基質、胞外基質組成、大分子復合物等;分子功能主要包括結合、催化活性、轉運體活性、分子功能調節子、分子轉化活性、信號轉化活性等。見圖8。模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組差異表達基因主要注釋到生物學過程類別，包括單生物體過程、細胞過程、生物調節、刺激應答、代謝途徑、多細胞生物體過程、定位等;細胞組分類別主要包括細胞、細胞組成、細胞器、細胞膜、膜組成、胞外基質、胞外基質組成、細胞器組成、大分子復合物等;分子功能主要包括結合、催化活性、轉運體活性、分子功能調節子、信號轉化活性、分子轉化活性等。見圖9。

2.4.4 差異表達基因KEGG通路富集分析結果 ? 模型組對比正常組差異表達基因顯著富集的前20條信號通路有丙肝、甲流、色氨酸代謝、RIG-1樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、cAMP信號通路、Toll樣受體信號通路等。見圖10。模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組差異表達基因顯著富集的前20條信號通路有代謝相關通路（超過20個基因）、cAMP信號通路、PPAR信號通路、TGF-β信號通路、cGMP-PKG信號通路等。見圖11。

3 討論

本觀察組前期研究發現活血降糖飲不僅能有效地改善胰島素抵抗，增加胰島素敏感性，調節糖脂代謝紊亂，減少蛋白尿，延緩腎功能下降[7-9]。而本次基礎研究也表明其不僅能降低血糖、血脂，亦能減少尿蛋白及尿微量白蛋白排泄量;此外，HE染色、Masson染色、PAS染色均提示模型組中腎組織發生了明顯的病理變化，而給藥組能有效改善，電鏡結果提示DN大鼠腎小球毛細血管基底膜均勻增厚，腎足細胞發生融合，而給藥組能改善腎小球GBM和系膜細胞功能，進一步說明了活血降糖飲能通過改善腎組織結構功能、減輕足細胞損傷、減少腎組織纖維化程度以及糖原或多糖含量，從而延緩DN進展，與前期研究結果一致。

同時，本實驗還選取了正常組、模型組、模型+雙胍+中藥組的大鼠腎皮質組織進行轉錄組測序研究，進一步探尋活血降糖飲治療DN的關鍵作用靶點。結果表明，模型組對比正常組與模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組轉錄本中基因總量接近，模型組對比正常組上調或下調基因量與模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組下調或上調基因量接近，其中篩選出差異最明顯的反向調控基因10個。根據GO富集分析，模型組對比正常組與模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組差異表達基因均主要注釋到生物學過程類別，包括細胞過程、單生物體過程、生物調節、代謝途徑等。KEGG前20條顯著富集通路分析顯示模型組對比正常組與模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組共同作用的信號通路有代謝相關通路及cAMP信號通路。

Cftr即囊性纖維化跨膜電導調節因子，是一種環磷酸腺苷（cAMP）依賴的跨膜氯離子通道蛋白，存在于多種組織、器官如呼吸道、消化道、生殖道、汗腺等的上皮細胞頂側膜，在上皮液體分泌過程中具有重要作用。有研究發現Cftr在糖尿病胰島B細胞中低表達是β細胞胰島素分泌減少和功能受損的一個重要因素[12]，其參與調控β細胞分泌功能，并通過此功能參與調節胰島損傷。Cftr激活途徑有2條：cAMP依賴的PKA途徑及效應劑直接與蛋白質作用從而改變CFTR的構象。當cAMP濃度升高時，CFTR蛋白構型改變、通道開放、氯離子外流。陰離子的主動運輸促使陽離子分泌，進而導致水沿著滲透梯度排放，在維持人體電解質的平衡和內穩態方面發揮重要作用。前期研究發現活血降糖飲能增加糖、脂毒性導致的受損胰島素細胞內cAMP含量，cAMP濃度增加并激活蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA），通過cAMP/PKA激酶通路增強β細胞內胰島素基因的轉錄和翻譯，并提高對葡萄糖刺激信號的敏感性，從而增加胰島素分泌量[13]。本研究結果顯示CFTR跨膜離子通道在模型組對比正常組表達明顯降低，而在模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組表達明顯升高，表明活血降糖飲治療DN可能是通過作用于cAMP/PKA通路上調Cftr從而改善胰島細胞功能降低血糖實現的。

丙酮酸脫氫酶復合物（PDC）可以催化線粒體中丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，是葡萄糖氧化的關鍵調節酶。丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）磷酸化PDC從而抑制其活性。Pdk4即丙酮酸脫氫酶激酶4，是PDK同工酶中的一種，在骨骼肌、肝臟、腎臟等具有高度的脂肪酸氧化能力，是PDC調節物質代謝的中心，是丙酮酸氧化和葡萄糖維持體內平衡的關鍵酶[14-15]。研究發現，PDK4表達上調可使葡萄糖向脂肪酸轉換，誘導胰島素抵抗，加速血糖升高和糖尿病病情的進展[16]，而抑制Pdk4表達可提高PDC活性，從而促進葡萄糖氧化，抑制無氧糖酵解和脂肪酸氧[17]，改善胰島素抵抗[18]。本研究發現，模型組對比正常組中Pdk4明顯上調，而在模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組明顯下調，提示Pdk4高表達降低了葡萄糖氧化水平，減少了組織對葡萄糖的攝取從而升高了血糖，而活血降糖飲可顯著下調Pdk4，可能與其能提高PDC活性，調節葡萄糖代謝及改善胰島素抵抗有關。

Angptl4即血管生成素樣蛋白4，是一種參與糖和脂質代謝的分泌型蛋白，與糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗有密切關系[19]。其作用主要體現在氧化代謝、血管發生創傷、修復及腫瘤轉移等方面。有研究發現，Angptl4可以損傷足細胞，致使機體發生腎小球病變進而產生大量蛋白尿，而在足細胞相關腎病中，也發現腎小球足細胞分泌的Angptl4表達增加[20-21]。本研究也發現模型組腎小球毛細血管基底膜均勻增厚，腎足細胞發生融合，模型組對比正常組Angptl4明顯上調，而經活血降糖飲治療后腎小球基底膜厚度均勻降低，足細胞融合度明顯減少，且模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組Angptl4明顯下調，證明活血降糖飲可能是通過抑制Angptl4的表達，從而改善足細胞的損傷，減少蛋白尿，以緩解糖尿病的進展。

Hmgcs2即3羥3甲基戊二酰輔酶A合酶2，是合成酮體的限速酶，其代謝產物酮體會誘導腎小管上皮細胞的轉分化及炎癥介質表達增加。有研究證實，腎小管損傷是DN的早期特征，腎小管病變可通過管球反射引起高濾過，從而導致腎小球的病變[22-23]。楊慧[23]研究發現，不論是糖尿病實驗鼠還是糖尿病患者的腎臟組織，Hmgcs2主要在表達在腎小管中。高血糖會誘導腎小管上皮細胞Hmgcs2表達增加，從而導致酮體合成增加，而酮體主要在近端腎小管被重吸收，會直接誘導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化及炎癥介質表達增加，從而加重腎小管的損傷，導致糖尿病的發生發展;此外，酮體還會刺激氧自由基的產生并導致脂質過氧化，而此會導致糖尿病血管疾病的發生[24-27]。在本研究中，模型組對比正常組Hmgcs2明顯上調，提示Hmgcs2是DN的潛在靶向基因，與目前關于Hmgcs2介導DN發生發展的研究結果相呼應;而模型+二甲雙胍+中藥組對比模型組Hmgcs2明顯下調，提示活血降糖飲可能通過下調DN腎小管中Hmgcs2的表達，減少酮體的生成從而保護腎臟以延緩DN進展。

其他差異表達較為明顯的反向調控基因LOC361914、Slc7a12、Gpa33、Prss35、Atp1a4、Atp12a在目前尚未發現與糖尿病及DN相關的作用機制研究，后期可立足于這些靶向基因進行進一步分子機制研究，為DN的防治提供有效途徑和新的藥物。

綜上所述，活血降糖飲聯合二甲雙胍能降低血糖、血脂，減少尿蛋白及尿微量白蛋白排泄量，改善腎功能，同時還能改善DN的腎臟病理改變。中醫學治療疾病常以多靶點、多途徑進行全面調節以及個體化治療方案為特點。本研究表明活血降糖飲治療DN可能是通過多靶點，多途徑實現的。其對DN的防治作用主要體現在改善胰島細胞功能、調節葡萄糖代謝、減輕腎小球足細胞損傷及腎小管損傷，而這些雙向調控的靶向基因是通過哪些通路以及具體分子機制還需進一步研究。

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（2019-09-03收稿 責任編輯：王明）