角叉菜膠致大鼠慢性前列腺炎模型的影響因素

朱佩軒 范瓊尹 張晶璇 高健 劉逍遙 趙睿學 蘇澤琦 王停

摘要 目的：明確角叉菜膠注射部位、注射濃度、注射劑量對慢性前列腺炎大鼠模型建立的影響，以形成穩定、可靠的模型制備方案。方法：選用成年雄性SD大鼠，采用角叉菜膠直接注射到前列腺的方法制備模型。分別考察不同注射部位（前列腺背側葉、腹側葉）、角叉菜膠不同濃度（1%、3%、5%）和注射劑量（50 μL、80 μL）對模型制備的影響，以前列腺組織HE染色結果為指標進行判定，同時對成模時間及穩定性進行考察。結果：1）僅注射腹側葉時，病理一致性較好，且操作簡便易行，模型穩定。2）每針注射50 μL較80 μL引起的病理改變更為均衡。3）注射1%角叉菜膠時病理改變較輕，注射3%角叉菜膠的模型一致性較好。4）角叉菜膠注射7 d、21 d、35 d后，均有符合慢性前列腺炎的炎癥反應。5）本模型病理改變以巨噬細胞增殖聚集為主，伴有一定程度的混合炎癥細胞（單核細胞、淋巴細胞、漿細胞等）浸潤。結論：在SD大鼠前列腺左、右腹側葉各注射兩針3%角叉菜膠50 μL（共計200 μL），可在7 d后成功建立慢性前列腺炎模型且模型能至少維持4周。本研究可為慢性前列腺炎動物模型的制備完善提供數據支撐，同時對于慢性前列腺炎發病機制研究及新藥研發具有理論指導意義。

關鍵詞 慢性前列腺炎;慢性骨盆疼痛綜合征;動物模型;大鼠;角叉菜膠;病理;模型評價

Abstract Objective：To explore injection site，injection concentration and injection dose on the establishment of chronic prostatitis rat model induced by carrageenan，so as to form a stable and reliable preparation of chronic prostatitis rat model.Methods：In this experiment，adult male SD rats of SPF grade were selected，and a chronic prostatitis model was induced by carrageenan injection into the prostate.Different injection sites（the dorsal lobe of the prostate，the ventral lobe of the prostate），different concentrations of carrageenan（1%，3%，5%），and different injection doses of carrageenan（50 μL and 80 μL per needle）were investigated.In all experiments，the results of hematoxylin-eosin staining of rat prostate tissue were used as an index for model judgment，the time to establish the model and the stability of the model was evaluated at the same time.Results：1）Compared with only injected the dorsal lobe or injected the dorsal lobe and the ventral lobes at the same time，the pathological consistency is better when only ventral lobes are injected，meanwhile the operation is more simple and the model is more stable.2）The pathological changes of the 50 μL per needle injection group were more balanced than the 80 μL per needle injection group.3）The pathological changes were the lightest when 1% carrageenan was injected，and the pathological changes of 3% and 5% carrageenan were heavier than 1%，and the model with 3% carrageenan had better consistency.4）There was an inflammatory response consistent with chronic prostatitis after 7 d，21 d，35 d injection with carrageenan.5）The pathological changes of rats chronic prostatitis induced by carrageenan are mainly the proliferation and aggregation of macrophages，accompanied by a certain degree of mixed inflammatory cells infiltration（monocytes，lymphocytes，plasma cells，etc.）.Conclusion：Based on the results of the study，two injections of 50 μL（200 μL in total）of 3% carrageenan were injected into both the left and right ventral lobes of the prostate of SD rats can make the chronic prostatitis model after 7 days and the model can be maintained for at least 4 weeks.This study can provide data support for the preparation of animal models of chronic prostatitis，and can provide theoretical guidance for the study of the pathogenesis of chronic prostatitis and the development of new drugs.

Keywords Chronic prostatitis; Chronic pelvic pain syndrome; Animal model; Rat; Carrageenan; Pathology; Model evaluation

中圖分類號：R284;R697文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.007

慢性前列腺炎（Chronic Prostatitis，CP）又稱慢性骨盆疼痛綜合征（Chronic Pelvic Pain Syndrome，CPPS），我國CP發病率為6.0%～32.9%，是泌尿外科的常見疾病之一[1]。臨床主要表現為尿急、尿頻、尿痛、尿不盡、陰囊潮濕、骨盆區域疼痛或不適等，嚴重影響患者生命質量[2]。CP病因復雜，發病機制尚未被完全闡明[3-4]，對其進行基礎研究具有重要意義。現有CP動物水平研究中，以應用角叉菜膠直接注射至大鼠前列腺中誘導CP發生為主要造模方法，但現有文獻對角叉菜膠的注射部位、注射濃度、注射劑量以及模型維持時間均無統一標準，未形成標準化實驗流程，實驗中的細節缺乏交待，導致在模型建立中出現大量重復性的工作。因此，本研究針對角叉菜膠致大鼠CP的關鍵因素，重點觀察上述因素對模型建立的影響，以形成相對穩定、炎癥反應程度較一致的模型制備方案，為CP動物水平的研究提供模型基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，9周齡，體質量350～380 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，動物合格證號：SYXK（京）2016-0038。動物飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物室，飼養期間自由攝食、飲水，光照周期明暗各12 h，溫度控制在（24±2）℃，相對濕度控制在40%～70%。實驗方案經北京中醫藥大學動物倫理委員會批準（動物倫理審批號：BUCM-4-2019102601-4027）。

1.1.2 試劑與儀器 角叉菜膠（SIGMA公司，美國，生產批號：C1013-25G）;0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，生產批號：1809252004）;硫酸卡那霉素（GENVIEW公司，中國香港，生產批號：AK177-25G）;10%甲醛中性組織固定液（南昌雨露實驗器材有限公司，生產批號：190515）;蘇木精-伊紅（HE）染色液套組（南昌雨露實驗器材有限公司，生產批號：190601）;一次性注射器（山東頤興醫療器械有限公司，生產批號：190309）;分體式包埋機（Leica公司，德國，型號：EG1150）;半自動輪轉式切片機（Leica公司，德國，型號RM2245）;病理圖像采集系統（OLYMPUS公司，日本，型號：BX53-DP26）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）角叉菜膠生理鹽水溶液的配制與模型制備方法。將0.1 g角叉菜膠定容于10 mL生理鹽水中，配制成1%角叉菜膠生理鹽水溶液。同理配置其他濃度角叉菜膠生理鹽水溶液。溶液全程在潔凈工作臺上配置并儲存于無菌離心管中。參考Yang等[5]的造模方法，用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（劑量：50 mg/kg）麻醉大鼠，用剃毛器剔除大鼠下腹部被毛。在無菌條件下，用聚維酮碘消毒大鼠腹部皮膚，于下腹部正中開約2 cm的縱切口，逐層打開后找到膀胱，將膀胱輕輕挑起，用1 mL無菌注射器將角叉菜膠生理鹽水溶液注入前列腺中。注射完畢后將臟器歸位，在傷口處滴適量抗生素以預防感染，逐層縫合肌肉、皮膚，用聚維酮碘消毒傷口并將傷口周圍的血跡擦凈，再將大鼠放回籠內，并對大鼠手術傷口和整體狀態進行密切觀察。2）角叉菜膠不同注射部位對模型的影響實驗分組。將12只大鼠采用隨機數字表法按體質量隨機分為A、B、C3個不同注射部位組，均采用文獻報道最小濃度即1%角叉菜膠生理鹽水進行注射。A組：前列腺左、右腹側葉各注射50 μL。B組：前列腺背側葉注射100 μL。C組：前列腺左、右腹側葉各注射50 μL，背側葉注射100 μL。在注射7 d后取材觀察病理指標，技術路線見圖1。3）角叉菜膠不同注射劑量對模型的影響實驗分組。將12只大鼠采用隨機數字表法按體質量隨機分為D、E 2個不同注射劑量組，根據“角叉菜膠不同注射部位對模型的影響實驗”結果，選取A組方案作為注射部位使用方案，同時提升注射濃度為3%并增加注射點為每側2針，其中，D組每針注射量為50 μL;E組每針注射量為80 μL。注射7 d后取材觀察病理指標，技術路線見圖2。4）角叉菜膠不同注射濃度對模型的影響及模型穩定性評價實驗分組。綜合上述2個實驗的研究結果，將33只大鼠采用隨機數字表法按體質量隨機分為F、G、H3組，分別給予1%、3%、5%角叉菜膠生理鹽水溶液，于前列腺左、右腹側葉各注射角叉菜膠溶液50 μL。在注射7 d后進行模型評價，并觀察注射后第21天、第35天的模型穩定性，技術路線見圖3。

1.2.2 檢測指標與方法 大鼠麻醉后取下前列腺組織，放入組織固定液固定24 h，根據HE染色標準化操作流程，進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，制成3～5 mm切片，HE染色后在光學顯微鏡下觀察前列腺組織病理形態。

1.3 統計學方法 對病理結果進行頻數和百分比統計。

2 結果

2.1 角叉菜膠不同注射部位對模型的影響 由于手術造成動物死亡，12只大鼠取材后共獲得合格樣本9個。其中，左、右腹側葉注射組（A組）100%出現了腹側葉巨噬細胞增殖聚集改變，同時50%的大鼠出現腹側葉混合炎癥細胞浸潤;僅注射背側葉組（B組）有33.3%出現背側葉巨噬細胞增殖聚集現象，亦有33.3%的巨噬細胞增殖聚集現象出現于腹側葉;左、右腹側葉及背側葉同時注射組（C組）僅在腹側葉出現了巨噬細胞增殖聚集和混合炎癥細胞浸潤，但3組的病理表現均為輕微或輕度。見表1、圖4。由此可見，A組方案即左、右腹側葉注射組病理一致性較好，但由于注射濃度及劑量較小，故病變程度較輕。

2.2 角叉菜膠不同注射劑量對模型的影響 當每針注射50 μL時（D組），大鼠前列腺同時出現巨噬細胞增殖聚集及混合炎癥細胞病理改變，且分布相對均衡;每針注射80 μL時（E組），有83.3%的大鼠出現了重度巨噬細胞增殖聚集及輕微的混合炎癥細胞浸潤。見表2、圖5。因此，每針注射50 μL更能體現慢性前列腺炎的炎癥狀態。

2.3 角叉菜膠不同注射濃度對模型的影響及模型穩定性評價結果 造模7 d后，G組1只因前列腺組織與腹腔粘連，未取獲取合格組織樣本;H組在造模手術后死亡1只，故最終納入合格大鼠13只。其中，注射1%角叉菜膠（F組）的病理改變最輕，注射3%角叉菜膠（G組）和5%角叉菜膠（H組）的病理改變均大于1%角叉菜膠組，且以3%角叉菜膠注射組（G組）的模型一致性較好。見表3、圖6。對各組模型穩定性進行評價，研究結果可知，在注射角叉菜膠21 d后，不同濃度組病理改變基本相當;在注射角叉菜膠35 d后，各組均有一定程度的病理改變，其中注射3%角叉菜膠組病理改變的持續性最好。故該模型在造模21 d后和35 d后仍具有穩定性，且注射3%角叉菜膠組（G組）的模型穩定性最佳。見表4、圖7。

3 討論

3.1 角叉菜膠致大鼠CP常用制備方案 目前雖然有較多研究在使用角叉菜膠致大鼠CP模型，但其中具體的實驗參數卻不盡相同。由于大鼠前列腺分為腹側葉（左右各一）及背側葉，故注射部位及取材部位的選擇尤為重要，同時，不同文獻報道了不同的注射劑量和注射濃度以及不同的成模周期和穩定性[5-16]。因此，經查閱相關文獻，將常用的角叉菜膠致大鼠CP模型制備方法及觀察內容進行總結。見表5。并在此基礎上設計并開展了本項研究工作。

3.2 角叉菜膠不同注射部位、劑量、濃度對CP模型的影響 通過研究可以看出，角叉菜膠不同注射部位、不同注射劑量以及不同注射濃度對大鼠慢性前列腺炎模型的最終形成均存在一定程度的影響。

在注射部位的選擇上，因大鼠前列腺有左、右腹側葉與背側葉之分，不僅需要考慮注射角叉菜膠后病理改變的一致性，實驗操作流程的便捷性和規范性也值得關注。從本實驗可以看出，腹側葉是角叉菜膠注射的理想位置。由于腹側葉靠近膀胱兩側，大鼠開腹后視野暴露良好，相較背側葉操作簡便，能夠有效避免因翻轉膀胱尋找背側葉所致的腹腔臟器牽拉，同時在病理表現上，單純注射腹側葉時各鼠病理改變相對一致。在實驗中還發現，無論是巨噬細胞增殖聚集，還是混合炎癥細胞浸潤，前列腺組織病理改變往往發生在角叉菜膠的注射部位附近，不易在全部前列腺中擴散，因此在實際操作過程中，左、右兩腹側葉側注射時位置應相對對稱，在進行模型評價及藥物干預研究中，也應選取注射部位附近的前列腺組織進行觀察，以保證實驗結果的真實性和可靠性。

在角叉菜膠注射劑量的選擇上，文獻報道中常見總注射劑量介于20～200 μL之間，腹側葉總的注射量為100 μL，發現引起的炎癥反應很輕，造成的模型難以評價藥效，故選擇了總注射量為200 μL（每針50 μL）。我們還對更高劑量（即總共320 μL，每針80 μL）進行了探究，前期預試發現若每針大于100 μL則可能導致溶液滲出，故選取了每針50 μL和100 μL中間的一個量，即80 μL。為了讓角叉菜膠更均勻地分布于前列腺組織，本研究優化了注射方法，運用了多點注射法，分別于左、右腹側葉各注射2針，在每側葉上1/3處和下1/3處進針，針尖朝向該葉中部進行注射，由于大鼠前列腺組織有一定的韌性，故在操作時應當平穩進針、緩慢推注，以免造成角叉菜膠漏出或對前列腺組織造成損害。操作流程規范化后，角叉菜膠能夠均勻注入大鼠前列腺組織中，且不會產生滲漏，保證了注射量的穩定性。通過比較每針50 μL和80 μL對模型的影響，我們可以看到，每葉各注射50 μL時，大鼠的病理表現更為均衡，也更能體現慢性前列腺炎的炎癥狀態。因此，我們最終確立了在左、右腹側葉各注射2針，每針50 μL，合計200 μL的注射方法。

在角叉菜膠注射濃度的選擇上，文獻報道中多為1%和3%，我們對更高濃度5%也進行了探究，故設計了1%、3%、5%3個濃度組，研究結果顯示3%的病理結果一致性較好。1%濃度的角叉菜膠造成的炎癥反應較輕，在后續的藥物干預實驗中，不便于評價藥物的療效;5%濃度的角叉菜膠比較黏稠，容易出現抽取到注射器時較困難和溶解度不佳的問題，最終影響了模型的病理評價。

關于模型的成模時間及穩定性，文獻報道中以注射后7 d成模為多，觀察節點最遲在注射后30 d。我們在實驗中對此進行了驗證，發現在注射7 d后能成功制作該模型，模型在注射后第21天和注射后第35天仍有較好的穩定性，故得出該模型成模后至少能維持4周，在藥物干預實驗中能滿足給藥4周以內的要求。

綜合研究結果，應用角叉菜膠誘導的大鼠CP模型時，最優方案為用3%角叉菜膠生理鹽水向前列腺左、右腹側葉各注射兩針，每針50 μL，手術7 d后能制作成較穩定的CP模型，且該模型能維持至少4周。

3.3 CP模型制備中的其他關鍵因素 本研究除了考察角叉菜膠注射部位、劑量、濃度及模型穩定性因素之外，對于影響CP模型制備的其他關鍵因素也進行了總結和思考。首先，在大鼠種屬選擇上，雖然SD大鼠、Wistar大鼠、Lewis大鼠、Wistar大鼠、Copenhagen大鼠均有報道用以制備CP模型，但本研究最終選取SD大鼠，是因為相較其他4種大鼠，其自發CP的概率較低，能夠避免自發性CP發生對模型建立的影響[17]，且SD大鼠具有較好的適應性和抗病能力，能夠更好地耐受手術創傷。其次，在CP臨床患者觀察中，其病理表現主要為混合炎癥細胞浸潤[18-19]，而角叉菜膠誘導所致的CP大鼠模型則表現為以巨噬細胞增殖聚集為主，伴有散在混合炎癥細胞浸潤的病理改變，存在一定的物種差異。這是由于慢性前列腺炎為非特異性慢性炎癥，又以單核巨噬細胞系統的激活作為重要特征[20]，由于混合炎癥細胞浸潤直接反映機體對損傷的持續炎癥反應，故在臨床中為慢性前列腺炎的典型病理表現。而混合炎癥細胞包含單核細胞、淋巴細胞、漿細胞，單核巨噬細胞系統包括血液中的單核細胞和組織中的巨噬細胞，故在大鼠CP模型中，出現了以巨噬細胞增殖聚集為主，伴有散在混合炎癥細胞浸潤的現象，因此在評價大鼠CP病理表現時，不能簡單地與臨床CP病理表現相對應，需加以區別應用。與此同時，病理觀察時顯微鏡物鏡的放大倍數對于觀察大鼠前列腺組織的炎癥表現也存在一定的影響，我們初期根據常規觀測倍數采用物鏡放大40倍進行觀察，但視野偏小，后期通過調整發現，物鏡放大倍數為20倍時即可清晰觀察病變部位，且視野更廣，更便于病理結果的評價，故采用物鏡放大倍數為20倍較為適宜。

本研究所采用的角叉菜膠是從紅藻中提取而得到的一種多糖，含有多個重復的D-半乳糖與3，6-無水-D-半乳糖，平均分子量大于100 kDa[21]，是誘導非特異性炎癥的經典試劑。除應用角叉菜膠進行CP誘導之外，還有以下幾種CP模型的常用建立方法。1）化學性誘導CP模型：如Lang等[22]使用化學刺激物（乙醇和二硝基苯磺酸）來去除前列腺黏膜內表面的屏障作用，誘導大鼠無菌性前列腺炎的發生;2）自發性CP模型：如Naslund等[23]研究發現，Lewis大鼠和Wistar大鼠均可自發CP，且前者的發病率高于后者;3）去勢結合雌激素誘導CP模型：Wilson等[24]和Kamijo等[25]采用大鼠去勢加雌二醇誘導CP發生;4）自身免疫反應誘導CP模型：如Jackson等[26]利用不同鼠種研究探索自身免疫性建模方式在不同群種鼠類上的特異性等。此4種模型分別針對CP不同的發病原因和發病機制而設，在特殊類型的CP模型構建中常被使用。由于角叉菜膠誘導的化學性CP模型造模方法較簡單，建模成本低，成模時間短，僅需7 d，受其他因素的干擾較少，故在實驗中更為常用[27]。

此外值得注意的是，在造模手術中，應嚴格執行無菌操作，注意避免臟器牽拉，不要損傷膀胱等重要臟器，縫合前應將各臟器歸回原位。手術用縱切口比橫切口能減少出血量，手術縫合完畢后，應該用聚維酮碘仔細消毒，并將血跡擦干凈，防止大鼠嗅到氣味后，咬斷縫合線。如果手術中損傷了膀胱等臟器，或出血較多，或血跡未擦干凈等均會增加大鼠感染和死亡的概率，因此，熟練的操作技術和對細節的把控對于角叉菜膠致CP模型的成功制備具有重要意義。

CP作為臨床常見疾病，積極開展基礎研究，探尋其發病機制、尋找有效治療手段具有重要的臨床意義和研究價值。動物模型是開展基礎研究的前提，本研究針對角叉菜膠致大鼠CP模型制備中的關鍵因素進行了探索，明確了角叉菜膠注射部位、劑量、濃度等對CP模型的影響，并在最優因素組合基礎上評價了模型的穩定性，同時針對CP大鼠模型制備中的難點問題進行了思考，為CP整體動物水平的研究提供簡便、可靠、易于推廣應用的動物模型。在未來的研究中，我們將進一步關注角叉菜膠致大鼠CP模型的宏觀、微觀指標變化，通過對比臨床CP患者與大鼠CP模型的異同點找到可能的干預靶標，為CP的發病機制研究及新藥研發提供更多實驗室依據和數據支撐。

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（2020-08-31收稿 責任編輯：張雄杰）