高耐受釀酒酵母的篩選及酵母曲制備工藝的優化

李曉歡，何宏魁，2，李冬冬，李 蘭，曹潤潔，周慶伍，2

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州 236820；2.安徽省固態發酵工程技術研究中心，安徽亳州 236820）

長期以來，濃香型白酒一直占據著白酒消費的主流市場，但其產能一直深受夏季“壓池子”工藝的制約。夏季環境溫度高導致入池酒醅溫度高，不利于酵母菌的生長繁殖和產酒。同時在白酒的整個發酵過程中窖池的pH 值是逐漸降低的，當窖池酸度下降至pH≤4.5 后，酵母菌的生理代謝活動逐漸受到抑制，對發酵原料的轉化利用能力及乙醇的發酵生產能力也逐漸下降，甚至停止[1-2]。因此，選育能夠在白酒發酵生產后期的高酸度環境條件下以及在夏季高溫高酸度的環境下仍具有旺盛的生理代謝活動、較強原料轉化利用及乙醇發酵生產能力的釀酒酵母菌，是傳統白酒生產過程中提高原料轉化利用率和白酒產量的技術關鍵。

本研究以大曲為研究對象，通過菌種的分離、純化、擴培以及篩選、鑒定等相關試驗，從大曲中篩選出一株耐酸、耐高溫且產酒能力強的酵母菌。對篩選出的優良酵母菌的酵母曲制備工藝進行優化，最終研制成性能良好的釀酒酵母曲，為今后酵母曲的推廣應用提供質量保障。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 耗材及試劑

實驗材料：濃香型大曲。

培養基：①孟加拉紅培養基，121 ℃滅菌30 min；②種子培養基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母膏10 g，蒸餾水1000 mL，pH5.0～5.5，115 ℃滅菌20 min；③固體培養基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母膏10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL；④固態培養基：麩皮、水。

1.1.2 實驗儀器

SX-700 高壓滅菌鍋（日本，TOMY）、Heratherm IMH400-S 生化培養箱、MaxQ-485HP 震蕩培養箱、200 L 不銹鋼發酵罐系統、3 噸級圓盤制曲機。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株初篩

將濃香型大曲制備成菌懸液，進行梯度稀釋后涂布到孟加拉紅培養基中，挑取單菌落，對濃香型大曲中的酵母菌進行分離純化，利用TTC法初篩出產酒能力較強的酵母菌[3]。

TTC 法：將TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)加入固體培養基中，再將分離純化出的酵母菌劃線至固體培養基，28 ℃恒溫培養，TTC 作為顯色劑對酵母的代謝產物發生呈色反應，可以判斷酵母生長過程呼吸酶活力的大小[4-5]（即酵母產酒精能力的強弱）。

1.2.2 菌株復篩

從耐酸性、耐溫性、產酒能力等方面對初篩出的酵母菌株進行復篩，最終篩選出產酒能力、耐酸、耐高溫性能具佳的酵母菌株。

1.2.3 酵母曲制備單因素條件優化

酵母曲生產工藝見圖1。根據酵母菌特性從酵母曲培養時間、培養溫度、培養基小麥粉添加量、培養基水分、種子液接種量幾個方面進行單因素實驗，以制備出的酵母曲中酵母菌活菌數為酵母曲質量判斷標準。

1.2.4 酵母曲制備正交實驗設計

在單因素試驗的基礎上，設計L9(33)正交試驗對酵母曲圓盤生產工藝進行優化設計。選取培養時間、培養基水分、培養基小麥粉添加量3 個因素進行考察，每個考察因素設立3個水平進行試驗。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

2.1.1 TTC初篩

根據酵母在培養基上的菌落特征，挑起具有代表性、出現頻率較高的菌落純化，獲得41 株酵母菌。TTC 法初篩，其中產酒能力較強的菌株顏色為深紫色，次之成粉色，如圖2所示。

結果顯示：編號為YTHG01、GJYD02、NJ-9 的3株菌株顏色較深，呈深紫色。

2.1.2 復篩

2.1.2.1 菌種耐高溫性能實驗

將種子液接種于液體培養基中，分別置于28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃和45 ℃條件下靜止發酵24 h，在660 nm 下測定培養液吸光值（OD），以空白培養基為對照，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，初篩出的YTHG01、GJYD02、NJ-9 這3 株菌均能在45 ℃條件下生長，且YTHG01和GJYD02較NJ-9生長較好。

2.1.2.2 菌種耐酒精能力實驗

將種子液分別接種于乙醇起始濃度為0%vol、5%vol、10%vol、15%vol、20%vol 的液體培養基中，置于28 ℃恒溫培養箱中靜止培養24 h，觀察菌種生長情況，在660 nm 下測定培養液吸光值（OD），以空白培養基為對照，結果如圖4所示。

由圖4 可以看出，3 株菌均在酒精含量15%vol時OD 值仍達到0.4 左右，可見菌株可耐受15%vol以上的酒精含量，且GJYD02 菌株的酒精耐受性最強。

2.1.2.3 菌種耐酸能力性能實驗

將種子液接入至初始pH 值不同（pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）的液體培養基中，在28 ℃振蕩培養24 h，利用分光光度計在660 nm 下測定菌液OD值，以空白培養基為對照，結果如圖5所示。

由圖5 可以看出，在pH 值2～7 范圍內，隨著pH 值的升高，酵母菌株的生長狀況越好，當pH3 時3 株初篩出的酵母菌均能生長，而在pH2 時，只有GJYD02 生長較好，可見GJYD02 菌株可耐受pH2的高酸環境，耐酸性能較好。

2.1.2.4 產乙醇能力實驗

種子液按照10%的接種量接種于高粱培養基中，28 ℃培養，分別對發酵3 d、5 d、7 d 的發酵液測定餾出液酒精度，結果如表1所示。

表1 不同菌株隨發酵時間產乙醇情況 (%vol)

由表1可以看出，GJYD02菌株產乙醇量最高。

2.1.2.5 杜氏小管乙醇耐受性驗證試驗

根據以上實驗結果，選取耐酸、耐高溫性較好、產乙醇能力較強的GJYD02 菌株進行乙醇耐受性驗證試驗[6]，按照10%的接種量將菌株接種到乙醇濃度不同的液體培養基中，培養24 h 后，觀察酵母產氣情況，結果如表2所示。

從表2 可以看出，酒精濃度低于17%vol 時，都能有明顯的產氣，17%vol、18%vol 有微弱的產氣，19%vol 后產氣不明顯；綜上，GJYD02 酵母菌的乙醇耐受性為18%vol。

2.1.2.6 菌種分子鑒定結果

提取GJYD02 酵母菌的基因片段，測序得到的26S rDNA 基因序列，保留其可靠的587 bp 序列進行系統發育分析，通過NCBI 的BLAST 比對，獲得同源性較高的已知分類單元，然后用MEGA6 軟件將這些序列構建系統發育樹見圖6。

GJYD02 的可靠序列與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的序列相似性為100%，因此確定復篩出的耐酸、耐高溫、產酒能力強的優良酵母GJYD02為1株釀酒酵母。

表2 菌株乙醇耐受性實驗結果

2.2 酵母曲制備單因素試驗

將篩選出的優良釀酒酵母用于酵母曲生產，目的就是為了利用原料富集該優良酵母，因此以酵母曲中酵母菌的數量作為酵母曲質量的判斷標準[6-8]。

2.2.1 培養基水分對制備酵母曲的影響（圖7）

分別制備水分含量為40%、45%、50%、55%、60%的固態培養基，接種相同量的酵母菌液，28 ℃恒溫培養24 h，對曲樣進行低溫風干，測定每克絕干曲中酵母菌活菌數。根據試驗結果可以看出，在培養基水分為45%、55%時，酵母曲中活菌數最多。

2.2.2 小麥粉對制備酵母曲的影響

麩皮中淀粉含量較少，不能為酵母的生長提供足夠的碳源，小麥是制備濃香型大曲的主要原料，且小麥淀粉含量高，因此本實驗考察在固態培養基中分別添加0%、10%、20%、30%、40%的小麥粉對酵母曲制備的影響，結果如圖8所示。

根據試驗結果可以看出，在固態培養基中添加一定量的小麥粉對酵母曲中的酵母數影響較顯著，當添加量為10%時，酵母曲中的酵母菌數較高，然后逐漸下降。

2.2.3 培養時間對制備酵母曲的影響（圖9）

將酵母菌液以10%的接種量接入固態培養基中，考察28 ℃情況下，培養時間（24 h、36 h、48 h）對酵母曲制備的影響。結果表明在24 h 時酵母曲中活菌數最多，隨著時間的延長，菌量會有所下降。

2.2.4 菌種添加量對酵母曲制備的影響（圖10）

接種量的大小可以決定菌種在固態培養基中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短酵母曲的培養時間，并可減少染雜菌的幾率，但較大接種量會增加種子液制備的難度，造成生產成本的增加，也會對酵母曲的活性產生一定影響。

接種量在2%～8%范圍內，隨著接種量的增加，制備出的酵母曲中的活菌數逐漸增加，之后接種量增加，活菌數變化不明顯。從實驗結果可以看出最佳接種量為8%。

2.3 正交試驗設計

如上單因素分析表明，培養時間、培養基水分、培養基中小麥粉的添加量對酵母曲制備影響較為顯著，故圍繞各因素的最優點，設計正交實驗方案，結果如表3。

正交實驗結果分析表明，制備酵母曲過程中影響酵母曲質量的3 個因素的主次順序為培養基小麥粉添加量、培養時間、培養基水分，且最優組合條件為A3B2C2，即小麥粉添加量為10%、培養時間為24 h、培養基水分為60%。該結果與直接分析結果一致。通過實驗驗證，在最優條件下進行酵母曲制備，酵母曲中酵母菌數驗證結果為7.5×108cfu/g，比初始條件下酵母曲中酵母菌數增加了50%。

表3 正交實驗方案與結果

3 結論

本試驗從濃香型大曲中分離純化出酵母菌，首先通過TTC 法進行初篩，其次從產酒能力、耐酸性、耐高溫性等方面進行復篩，最終篩選出1 株具有產酒能力強、耐酸、耐高溫性能特點優良的酵母菌種，經分子生物學鑒定，確定該酵母菌為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。將該株釀酒酵母作為生產菌種用于酵母曲的制備，制備出富含此優良釀酒酵母的酵母曲。對酵母曲的制備工藝進行優化，通過對固態培養基水分、酵母曲培養時間、酵母菌接種量、培養基小麥粉添加量等因素進行單因素試驗，并在單因素試驗的基礎上，選擇對酵母曲質量影響較大的固態培養基水分、酵母曲培養時間、培養基小麥粉添加量3 個因素進行L9(33) 正交試驗，獲得了釀酒酵母制備酵母曲的較優的制備工藝，即小麥粉添加量為10%、培養時間為24 h、培養基水分為60%。在最優條件下進行酵母曲制備，酵母曲中酵母菌數驗證結果為7.5×108cfu/g，比初始條件下酵母曲中酵母菌數增加了50%。綜上所述，本文將大曲中篩選出的優良釀酒酵母應用于酵母曲生產中，并對酵母曲制備工藝進行優化，制備出的酵母曲發酵能力強，耐高溫，耐強酸，生產周期短，適用于白酒生產中。